【摘 要】
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目的构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库筛选GPC3抗体。方法通过PCR从含有全长GPC3的质粒
【机 构】
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广西医科大学,军事医学科学院放射与辐射医学研究所,
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目的构建C-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)基因真核表达质粒,表达C-GPC3蛋白,并通过哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库筛选GPC3抗体。方法通过PCR从含有全长GPC3的质粒中扩增C-GPC3基因,将其克隆至p3457-his载体中,构建重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,转染293T细胞,对C-GPC3蛋白的表达进行Western blot鉴定。将质粒p3457-C-GPC3瞬时转染293E细胞,获得C-GPC3蛋白,采用Ni亲和柱纯化后,进行FITC标记。以本课题组构建的哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库为起始文库,FITC-C-GPC3抗原按照10、2和0.8 nmol/L的浓度梯度,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例约为0.1%的阳性细胞。结果重组表达质粒p3457-C-GPC3经菌液PCR和测序鉴定证明构建正确;瞬时转染293T和293E细胞均可表达相对分子质量约为25 000的C-GPC3蛋白;获得了可与C-GPC3结合的阳性率约为0.1%的阳性细胞。结论成功构建了重组真核表达质粒p3457-C-GPC3,并从哺乳动物展示型全人源sc Fv抗体库中筛选出了阳性细胞,为后期全人源GPC3抗体的构建和表达奠定了基础。
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