【摘 要】
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以大肠杆菌作为嘧啶核糖核苷水解酶（pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA，RihA）表达宿主，利用生物转化的方法将尿苷高效转化为尿嘧啶。首先构建pET22b-RihA质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达，研究尿苷的转化情况。采用优化pET22b-RihA质粒信号肽和与分子伴侣质粒共表达两种策略进一步提高大肠杆菌转化尿苷的效率。来源
【基金项目】
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国家重点研发计划（2021YFC2101802,2021YFC2100403）； 国家自然科学基金项目（32072161）；
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以大肠杆菌作为嘧啶核糖核苷水解酶（pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA，RihA）表达宿主，利用生物转化的方法将尿苷高效转化为尿嘧啶。首先构建pET22b-RihA质粒，在大肠杆菌BL21（DE3）中重组表达，研究尿苷的转化情况。采用优化pET22b-RihA质粒信号肽和与分子伴侣质粒共表达两种策略进一步提高大肠杆菌转化尿苷的效率。来源于碱性磷酸酶的PhoA信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株F在投底物发酵时转化效果最好，当底物浓度为65 g/L转化15 h时，菌株F几乎将尿苷完全转化，尿苷转化率达到98.9%，而原始菌株A的尿苷转化率仅为80.2%。进一步对菌株F转化尿苷的浓度进行优化，投入一倍体积的尿苷底物后继续培养约53 h尿苷转化完全，得到尿嘧啶产量为73.45 g/L，尿嘧啶产率为98.16%。发酵液上清中RihA酶活最高的为PelB信号肽和分子伴侣GroES-GroEL共表达的菌株C，其RihA酶活是原始菌株A的10.0倍。其中总可溶性RihA酶活最高的为PhoA信号肽和分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE共表达的菌株G，其RihA酶活是原始菌株A的4.45倍。通过优化信号肽和分子伴侣，提高了尿苷的转化效率，并建立了一种高效的利用大肠杆菌全细胞催化生产药物中间体尿嘧啶的方法。与化学合成方法生产相比，避免了繁琐的生产工艺步骤，对环境友好绿色。
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