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摘要 黏虫是我国作物上最重要的害虫之一。细胞色素P450能够参与昆虫外源物质代谢。本研究采用RACE技術克隆了一条编码黏虫P450基因的cDNA序列，并通过Real-time PCR技术，检测了4种外源物质对该基因表达的诱导效应。该基因被国际P450命名委员会命名为CYP9A113，GenBank登录号为KY436739。利用2.5%高效氯氟氰菊酯乳油的LD50处理黏虫3 h，LD10、LD30和LD50处理12 h和24 h，可诱导表达CYP9A113基因;20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂的LD10处理黏虫12、24和48 h，LD30和LD50处理24 h，CYP9A113基因表达呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL香豆素处理6、12、24和48 h，CYP9A113基因表达均呈诱导效应;0.1和0.5 mg/mL吲哚-3-甲醇处理3、6、12、24和48 h，CYP9A113基因表达均呈诱导效应。
关键词 黏虫; CYP9A113基因; 克隆; 外源物质; 诱导效应
中图分类号： S 435.132
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018358
细胞色素P450酶（P450s或CYPs）是一类亚铁血红素硫醇盐蛋白[1]，在哺乳动物的肝微粒体中首次被发现[2]，现已证明几乎在所有生物体内广泛存在。自1965年Ray在昆虫体内发现P450后[3]，目前已经克隆得到分属于CYP2、CYP3、CYP4和线粒体P450s的多个昆虫细胞色素P450基因序列[4]，其中CYP3分支又包括CYP6和CYP9家族[5]，这些基因既能催化激素、信息素、脂肪酸等内源物质的合成，又能参与杀虫剂、诱变剂、植物次生代谢物质等外源物质的代谢，对昆虫的生长发育起着非常重要的作用[68]。采用98%氯氰菊酯（55 ng/μL）对野桑蚕Bombyx mandarina点滴1 μL处理后，脂肪体中CYP9A20和CYP9A21基因表达量均升高[9];甘蓝夜蛾Mamestra brassicae经0.5 μL 2.5%溴氰菊酯水乳剂（0.152 ng/g）处理后，CYP9A90基因表达量总体呈诱导趋势[10];甜菜夜蛾Spodoptera exigua经95%氯虫苯甲酰胺（0.01 mg/kg和0.02 mg/kg）处理后，CYP9A9基因相对表达量升高[11];香豆素可诱导斜纹夜蛾Spodoptera litura脂肪体中CYP4M14和CYP6AB14基因的表达[1213]。吲哚-3-甲醇处理可诱导飞蝗Locusta migratoria体内CYP6HL1和CYP6FE12基因的表达[14]。
黏虫Mythimna separata属于鳞翅目，夜蛾科，是粮食作物上的重要害虫之一[15]，在多个国家广泛分布，我国除西藏地区未见报道外，其他各地均有报道[16]。本研究克隆黏虫CYP9家族的一条P450基因，选取生产上常用于防治黏虫的杀虫剂2.5%高效氯氟氰菊酯乳油、20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂和黏虫豆科寄主植物中含有的次生代谢物质香豆素[17]、十字花科蔬菜活性成分吲哚-3-甲醇[18]，对其进行诱导效应的研究，探究该基因在黏虫外源物质解毒和对自然环境的适应性方面的重要作用，为利用分子手段防治该害虫奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
黏虫M.separata采自东北农业大学向阳实验基地，黑光灯诱集成虫后于实验室以5%的蜂蜜水饲养，幼虫用玉米叶饲养，均放入恒温培养箱中，温度为（25±1）℃，相对湿度为70%，光周期为L∥D=16 h∥8 h。在实验室饲养2代后用作试验材料。
1.2 供试试剂与药剂
TRIzol Reagent试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、低熔点琼脂糖购于Promega公司;3′RACE试剂盒、5′RACE试剂盒、DNA纯化试剂盒和Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix购于TOYOBO公司;2.5%高效氯氟氰菊酯乳油（EC）购于青岛星牌作物科技有限公司，20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂（SC）购于美国杜邦公司;香豆素（coumarin）和吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol）购于合肥博美生物科技有限公司;其余试剂为国产或进口的分析纯。由上海生工生物有限公司完成基因的测序和引物合成。
1.3 CYP9A113基因序列的克隆及分析
1.3.1 总RNA的提取以及cDNA的合成
选择健康的4龄黏虫幼虫为样本，采用TRIzol提取法提取总RNA，按照反转录试剂盒的说明书合成cDNA，并保存于-20℃冰箱，剩余的RNA保存于-80℃冰箱备用。
1.3.2 全长基因序列的克隆
将GenBank上已经登录的甘蓝夜蛾M.brassicae CYP9A90（KR676343）和棉铃虫Helicoverpa armigera CYP9A12（AY371318）基因的序列进行比对，设计黏虫保守区上下游特异性引物Ms9A-F和Ms9A-R（表1）。以1.3.1中合成的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测，目的片段胶回收测序。根据3′RACE和5′RACE试剂盒中自带的引物3′RACE-Ro、3′RACE-Ri和5′RACE-Ro、5′RACE-Ri，分别设计对应的嵌套引物Ms9A-3′RACE-Ro、Ms9A-3′RACE-Ri和Ms9A-5′RACE-Ro、Ms9A-5′RACE-Ri（表1）。按照试剂盒说明书，分别进行3′端序列和5′端序列的扩增，并进行胶回收测序。通过AlignX软件将保守区序列、3′端序列和5′端序列进行拼接，得到完整的基因序列。再设计全长引物Ms9A-Full-F和Ms9A-Full-R（表1）克隆全长序列进行验证，确定最终序列。 1.3.3 序列分析
该基因由国际P450命名委员会命名，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder （ORF Finder）將基因开放阅读框翻译成氨基酸序列;利用在线网站ExPASy （https：∥www.expasy.org/）进行功能域的预测;利用BioXM 2.6软件进行蛋白质分子量和等电点的计算;利用MEGA 5.1软件采用邻接（neighbor-joining）法构建系统进化树。
1.4 杀虫剂的诱导效应
1.4.1 高效氯氟氰菊酯的诱导效应
选取4龄第1天黏虫幼虫，称量单个虫体的重量，计算平均值，将2.5%高效氯氟氰菊酯EC用丙酮稀释成5个不同浓度，分别为33.33、16.67、8.33、4.17、2.08 μg/mL，以丙酮为对照。每个浓度药剂和对照均点滴0.5 μL于虫体的第2～3腹节之间，每处理20头，3次重复，于培养箱中正常饲养条件培养。24 h后检查死亡虫数，求出2.5%高效氯氟氰菊酯EC对黏虫的LD10、LD30和LD50。
选择4龄第1天黏虫幼虫进行试验，分别点滴0.5 μL LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC于黏虫幼虫2～3腹节之间，每处理和对照均点滴40头，共设3个重复，放在实验室饲养条件下培养，于3、6、12、24和48 h分别收集3头存活的幼虫，于液氮中速冻，放在-80℃冰箱中保存。每个重复的3头幼虫混合提取RNA后，根据荧光定量反转录试剂盒制备cDNA模板。采用SYBR Green染料3步法进行荧光定量，利用Primer 5.0软件设计荧光定量上下游引物Ms9A-RT-F和Ms9A-RT-R（表1），以黏虫β-actin作为内参基因，设计上下游引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。在荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX Connect）中进行反应，反应结束记录熔解曲线和相关数据，检测LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC处理不同时间CYP9A113基因的表达情况。
1.4.2 氯虫苯甲酰胺的诱导效应
选择4龄第1天黏虫幼虫进行试验，饥饿处理12 h后利用ddH2O将20%氯虫苯甲酰胺SC稀释成5个不同浓度，分别为5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 μg/mL，以ddH2O为对照，每个浓度20头黏虫，3个重复。将玉米叶用打孔器打成直径为1 cm的叶碟，其上点10 μL药液晾干备用，每个培养皿中均放入1头黏虫和1片叶碟，叶碟吃光后用未处理正常叶片喂饲。24 h后检查死亡虫数，求出20%氯虫苯甲酰胺SC对黏虫幼虫的LD10、LD30和LD50。
供试虫体的选择和试验方法同上，分别用LD10、LD30和LD50进行处理，以ddH2O作为对照，每处理和对照均饲喂40头，设3个重复，于3、6、12、24和48 h分别收集3头存活的幼虫，于液氮中速冻，放在-80℃冰箱中保存。提取RNA后，通过Real-time PCR检测LD10、LD30和LD50的20%氯虫苯甲酰胺SC处理不同时间CYP9A113基因的表达情况，具体步骤参照1.4.1。
1.5 植物次生代谢物质的诱导效应
选取4龄第1天幼虫进行试验，香豆素和吲哚-3-甲醇均设两个浓度，分别为0.1和0.5 mg/mL，用加热的无菌ddH2O稀释到所需浓度，对照为加热的无菌ddH2O。待溶液温度降到室温时，开始试验，之后的试验方法均参照1.4.2。提取RNA后，通过Real-time PCR检测不同浓度的2种植物次生代谢物质处理不同时间CYP9A113基因的表达情况，具体步骤参照1.4.1。
1.6 数据处理与分析
利用DPS软件进行回归统计分析;采用2-ΔΔCt法计算荧光定量PCR相对定量数据结果;数据的多重比较和差异显著性分析利用SAS 9.4软件Duncan氏检验法进行（P
关键词 黏虫; CYP9A113基因; 克隆; 外源物质; 诱导效应
中图分类号： S 435.132
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018358
细胞色素P450酶（P450s或CYPs）是一类亚铁血红素硫醇盐蛋白[1]，在哺乳动物的肝微粒体中首次被发现[2]，现已证明几乎在所有生物体内广泛存在。自1965年Ray在昆虫体内发现P450后[3]，目前已经克隆得到分属于CYP2、CYP3、CYP4和线粒体P450s的多个昆虫细胞色素P450基因序列[4]，其中CYP3分支又包括CYP6和CYP9家族[5]，这些基因既能催化激素、信息素、脂肪酸等内源物质的合成，又能参与杀虫剂、诱变剂、植物次生代谢物质等外源物质的代谢，对昆虫的生长发育起着非常重要的作用[68]。采用98%氯氰菊酯（55 ng/μL）对野桑蚕Bombyx mandarina点滴1 μL处理后，脂肪体中CYP9A20和CYP9A21基因表达量均升高[9];甘蓝夜蛾Mamestra brassicae经0.5 μL 2.5%溴氰菊酯水乳剂（0.152 ng/g）处理后，CYP9A90基因表达量总体呈诱导趋势[10];甜菜夜蛾Spodoptera exigua经95%氯虫苯甲酰胺（0.01 mg/kg和0.02 mg/kg）处理后，CYP9A9基因相对表达量升高[11];香豆素可诱导斜纹夜蛾Spodoptera litura脂肪体中CYP4M14和CYP6AB14基因的表达[1213]。吲哚-3-甲醇处理可诱导飞蝗Locusta migratoria体内CYP6HL1和CYP6FE12基因的表达[14]。
黏虫Mythimna separata属于鳞翅目，夜蛾科，是粮食作物上的重要害虫之一[15]，在多个国家广泛分布，我国除西藏地区未见报道外，其他各地均有报道[16]。本研究克隆黏虫CYP9家族的一条P450基因，选取生产上常用于防治黏虫的杀虫剂2.5%高效氯氟氰菊酯乳油、20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂和黏虫豆科寄主植物中含有的次生代谢物质香豆素[17]、十字花科蔬菜活性成分吲哚-3-甲醇[18]，对其进行诱导效应的研究，探究该基因在黏虫外源物质解毒和对自然环境的适应性方面的重要作用，为利用分子手段防治该害虫奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
黏虫M.separata采自东北农业大学向阳实验基地，黑光灯诱集成虫后于实验室以5%的蜂蜜水饲养，幼虫用玉米叶饲养，均放入恒温培养箱中，温度为（25±1）℃，相对湿度为70%，光周期为L∥D=16 h∥8 h。在实验室饲养2代后用作试验材料。
1.2 供试试剂与药剂
TRIzol Reagent试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、低熔点琼脂糖购于Promega公司;3′RACE试剂盒、5′RACE试剂盒、DNA纯化试剂盒和Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司;ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix购于TOYOBO公司;2.5%高效氯氟氰菊酯乳油（EC）购于青岛星牌作物科技有限公司，20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂（SC）购于美国杜邦公司;香豆素（coumarin）和吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol）购于合肥博美生物科技有限公司;其余试剂为国产或进口的分析纯。由上海生工生物有限公司完成基因的测序和引物合成。
1.3 CYP9A113基因序列的克隆及分析
1.3.1 总RNA的提取以及cDNA的合成
选择健康的4龄黏虫幼虫为样本，采用TRIzol提取法提取总RNA，按照反转录试剂盒的说明书合成cDNA，并保存于-20℃冰箱，剩余的RNA保存于-80℃冰箱备用。
1.3.2 全长基因序列的克隆
将GenBank上已经登录的甘蓝夜蛾M.brassicae CYP9A90（KR676343）和棉铃虫Helicoverpa armigera CYP9A12（AY371318）基因的序列进行比对，设计黏虫保守区上下游特异性引物Ms9A-F和Ms9A-R（表1）。以1.3.1中合成的cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测，目的片段胶回收测序。根据3′RACE和5′RACE试剂盒中自带的引物3′RACE-Ro、3′RACE-Ri和5′RACE-Ro、5′RACE-Ri，分别设计对应的嵌套引物Ms9A-3′RACE-Ro、Ms9A-3′RACE-Ri和Ms9A-5′RACE-Ro、Ms9A-5′RACE-Ri（表1）。按照试剂盒说明书，分别进行3′端序列和5′端序列的扩增，并进行胶回收测序。通过AlignX软件将保守区序列、3′端序列和5′端序列进行拼接，得到完整的基因序列。再设计全长引物Ms9A-Full-F和Ms9A-Full-R（表1）克隆全长序列进行验证，确定最终序列。 1.3.3 序列分析
该基因由国际P450命名委员会命名，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder （ORF Finder）將基因开放阅读框翻译成氨基酸序列;利用在线网站ExPASy （https：∥www.expasy.org/）进行功能域的预测;利用BioXM 2.6软件进行蛋白质分子量和等电点的计算;利用MEGA 5.1软件采用邻接（neighbor-joining）法构建系统进化树。
1.4 杀虫剂的诱导效应
1.4.1 高效氯氟氰菊酯的诱导效应
选取4龄第1天黏虫幼虫，称量单个虫体的重量，计算平均值，将2.5%高效氯氟氰菊酯EC用丙酮稀释成5个不同浓度，分别为33.33、16.67、8.33、4.17、2.08 μg/mL，以丙酮为对照。每个浓度药剂和对照均点滴0.5 μL于虫体的第2～3腹节之间，每处理20头，3次重复，于培养箱中正常饲养条件培养。24 h后检查死亡虫数，求出2.5%高效氯氟氰菊酯EC对黏虫的LD10、LD30和LD50。
选择4龄第1天黏虫幼虫进行试验，分别点滴0.5 μL LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC于黏虫幼虫2～3腹节之间，每处理和对照均点滴40头，共设3个重复，放在实验室饲养条件下培养，于3、6、12、24和48 h分别收集3头存活的幼虫，于液氮中速冻，放在-80℃冰箱中保存。每个重复的3头幼虫混合提取RNA后，根据荧光定量反转录试剂盒制备cDNA模板。采用SYBR Green染料3步法进行荧光定量，利用Primer 5.0软件设计荧光定量上下游引物Ms9A-RT-F和Ms9A-RT-R（表1），以黏虫β-actin作为内参基因，设计上下游引物β-actin-F和β-actin-R（表1）。在荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX Connect）中进行反应，反应结束记录熔解曲线和相关数据，检测LD10、LD30和LD50的2.5%高效氯氟氰菊酯EC处理不同时间CYP9A113基因的表达情况。
1.4.2 氯虫苯甲酰胺的诱导效应
选择4龄第1天黏虫幼虫进行试验，饥饿处理12 h后利用ddH2O将20%氯虫苯甲酰胺SC稀释成5个不同浓度，分别为5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 μg/mL，以ddH2O为对照，每个浓度20头黏虫，3个重复。将玉米叶用打孔器打成直径为1 cm的叶碟，其上点10 μL药液晾干备用，每个培养皿中均放入1头黏虫和1片叶碟，叶碟吃光后用未处理正常叶片喂饲。24 h后检查死亡虫数，求出20%氯虫苯甲酰胺SC对黏虫幼虫的LD10、LD30和LD50。
供试虫体的选择和试验方法同上，分别用LD10、LD30和LD50进行处理，以ddH2O作为对照，每处理和对照均饲喂40头，设3个重复，于3、6、12、24和48 h分别收集3头存活的幼虫，于液氮中速冻，放在-80℃冰箱中保存。提取RNA后，通过Real-time PCR检测LD10、LD30和LD50的20%氯虫苯甲酰胺SC处理不同时间CYP9A113基因的表达情况，具体步骤参照1.4.1。
1.5 植物次生代谢物质的诱导效应
选取4龄第1天幼虫进行试验，香豆素和吲哚-3-甲醇均设两个浓度，分别为0.1和0.5 mg/mL，用加热的无菌ddH2O稀释到所需浓度，对照为加热的无菌ddH2O。待溶液温度降到室温时，开始试验，之后的试验方法均参照1.4.2。提取RNA后，通过Real-time PCR检测不同浓度的2种植物次生代谢物质处理不同时间CYP9A113基因的表达情况，具体步骤参照1.4.1。
1.6 数据处理与分析
利用DPS软件进行回归统计分析;采用2-ΔΔCt法计算荧光定量PCR相对定量数据结果;数据的多重比较和差异显著性分析利用SAS 9.4软件Duncan氏检验法进行（P