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摘要：为了研究中国美利奴羊TOLL样受体（TLR4）基因第3外显子上的单核苷酸多态性（SNPS）和单氨基酸多态性（SAPS）。利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用SeqMan对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析，然后采用PCR-SSCP并结合测序的方法对119只中国美利奴羊TLR4基因的外显子3的扩增片段进行分析。通过分析发现，在中国美利奴羊第3外显子1 180 bp处有1个突变位点，由G突变成T，氨基酸由天冬氨酸（D）变成酪氨酸（Y），即该位点为有义突变。在1 537 bp处也有1个突变位点，即由G突变成了A，氨基酸由丙氨酸（A）变成苏氨酸（T），在TLR4第3外显子的其他位点并没有SNPS位点，说明中国美利奴羊TLR4基因上的第3外显子区域有2个多态位点。
关键词：中国美利奴羊；TLR4基因；多态性；生物信息学方法；PCR-SSCP；外显子；突变位点
中图分类号： S8268 62文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0027-05
收稿日期：2016-06-30
基金项目：国家“973”计划（编号：2010CB530200）。
作者简介：王会敏（1990—），女，硕士研究生，研究方向为动物基因工程。
通信作者：高剑峰，博士，教授，研究方向为动物功能基因组学与分子免疫学。E-mail：jianfengg@shuzueducn。
Toll样受体（toll-like receptor，TLR）最早是从果蝇体内分离得到的，它对果蝇腹背侧体轴的发展方向和非特异性免疫反应起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人体分离出果蝇TLR的同系物，从而发现人类及哺乳动物存在一个TLR家族，它是一种重要的模式识别受体，能识别微生物的多种成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，从而激活非特异性和特异性免疫反应，抵抗细菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10个TLR成员，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多态性可以使机体对疾病的遗传具有易感性和抗性，基因TLR位点多态性与炎性应答损伤和感染性疾病的遗传易感性相关[3-5]。TOLL样受体4是一种Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞内区、富含亮氨酸的胞外区和跨膜区[6]。TLR4广泛表达于哺乳动物细胞表面，在抗感染免疫中发挥重要作用。目前，关于TLR4的多态主要集中在人和小鼠的研究上。例如，刘继峰等对TLR2、TLR4基因多态性[CM（25]与尖锐湿疣患者易感性及复发性的相关性进行研究[7]。韩璐等TLR4基因的多态性与胃癌的关系[8]。赵刚等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液组胺浓度、TLR4基因多态性与抗蜱能力的关系发现，B等位基因可作为婆罗门杂交牛抗蜱选育的分子标记[9]。吕伟丽等用 PCR-SSCP 方法检测这4 种绵羊第3外显子的多态性发现，白萨福克羊、小尾寒羊和特克塞尔羊处于高度多态，而永昌羊处于中度多态[10]。鲜有关于绵羊TLR4基因的多态性与疾病关联的报道。中国美利奴绵羊是新疆绵羊毛肉兼用细毛羊品种的一种，具有优良的遗传稳定性，包括军垦型、科尔泌型、吉林型3种类型[11]。本试验以中国美利奴羊为材料，利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用SeqMan对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析，然后采用 PCR-SSCP技术并结合克隆测序的方法来检测中国美利奴羊TLR4基因的多态位点，从而为进一步研究标记辅助育种、培育中国美利奴绵羊抗性新品系奠定理论基础。
1材料与方法
11材料
111试验动物试验中的119只中国美利奴羊来自新疆建设兵团农九师第170团，取每只试验羊的颈静脉血于5 mL肝素钠抗凝管中，放入车载冰箱里带回实验室，然后放入 -40 ℃ 保存备用。
112主要试剂血液基因组试剂盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；过硫酸铵和去离子甲酰胺，均购自北京索莱宝科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和 TEMED，均购自美国 Am-resco公司；亲和硅烷、剥离硅烷，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。其他试剂均由实验室配制。
12方法
121生物信息学分析从NCBI上通过绵羊基因mRNA序列（登录号：XM_012111214 ）下载绵羊的编码区，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251
关键词：中国美利奴羊；TLR4基因；多态性；生物信息学方法；PCR-SSCP；外显子；突变位点
中图分类号： S8268 62文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）21-0027-05
收稿日期：2016-06-30
基金项目：国家“973”计划（编号：2010CB530200）。
作者简介：王会敏（1990—），女，硕士研究生，研究方向为动物基因工程。
通信作者：高剑峰，博士，教授，研究方向为动物功能基因组学与分子免疫学。E-mail：jianfengg@shuzueducn。
Toll样受体（toll-like receptor，TLR）最早是从果蝇体内分离得到的，它对果蝇腹背侧体轴的发展方向和非特异性免疫反应起重要的作用[1]。Medzhitov等首次在人体分离出果蝇TLR的同系物，从而发现人类及哺乳动物存在一个TLR家族，它是一种重要的模式识别受体，能识别微生物的多种成分如DNA、RNA、脂多糖、脂蛋白等，从而激活非特异性和特异性免疫反应，抵抗细菌、病毒的侵入[2]。TLR家族至少有10个TLR成员，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。TLR基因的多态性可以使机体对疾病的遗传具有易感性和抗性，基因TLR位点多态性与炎性应答损伤和感染性疾病的遗传易感性相关[3-5]。TOLL样受体4是一种Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含半胱氨酸的胞内区、富含亮氨酸的胞外区和跨膜区[6]。TLR4广泛表达于哺乳动物细胞表面，在抗感染免疫中发挥重要作用。目前，关于TLR4的多态主要集中在人和小鼠的研究上。例如，刘继峰等对TLR2、TLR4基因多态性[CM（25]与尖锐湿疣患者易感性及复发性的相关性进行研究[7]。韩璐等TLR4基因的多态性与胃癌的关系[8]。赵刚等利用 PCR-SSCP方法研究牛血液组胺浓度、TLR4基因多态性与抗蜱能力的关系发现，B等位基因可作为婆罗门杂交牛抗蜱选育的分子标记[9]。吕伟丽等用 PCR-SSCP 方法检测这4 种绵羊第3外显子的多态性发现，白萨福克羊、小尾寒羊和特克塞尔羊处于高度多态，而永昌羊处于中度多态[10]。鲜有关于绵羊TLR4基因的多态性与疾病关联的报道。中国美利奴绵羊是新疆绵羊毛肉兼用细毛羊品种的一种，具有优良的遗传稳定性，包括军垦型、科尔泌型、吉林型3种类型[11]。本试验以中国美利奴羊为材料，利用生物信息学方法对NCBI上公布的有关绵羊的TLR4序列进行下载并用SeqMan对下载的绵羊TLR4基因外显子进行多态性比对分析，然后采用 PCR-SSCP技术并结合克隆测序的方法来检测中国美利奴羊TLR4基因的多态位点，从而为进一步研究标记辅助育种、培育中国美利奴绵羊抗性新品系奠定理论基础。
1材料与方法
11材料
111试验动物试验中的119只中国美利奴羊来自新疆建设兵团农九师第170团，取每只试验羊的颈静脉血于5 mL肝素钠抗凝管中，放入车载冰箱里带回实验室，然后放入 -40 ℃ 保存备用。
112主要试剂血液基因组试剂盒、EB（核酸染料）、2×Taq PCR MasterMix、DL 2000 DNA Marker等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；过硫酸铵和去离子甲酰胺，均购自北京索莱宝科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和 TEMED，均购自美国 Am-resco公司；亲和硅烷、剥离硅烷，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。其他试剂均由实验室配制。
12方法
121生物信息学分析从NCBI上通过绵羊基因mRNA序列（登录号：XM_012111214 ）下载绵羊的编码区，并利用NCBI上的http：wwwncbinlmnihgovgene？term=CAQ378251