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摘要选用对吸胀冷害敏感的大豆品种[Glycine max（L.）Merr.]中黄22为试材，PEG引发处理不同时间，于恒温培养箱培养48h后提取种子子叶中的线粒体，不连续蔗糖梯度离心纯化后，测定线粒体中抗氧化酶和抗氧化剂的变化情况。结果表明：PEG引发处理后大豆种子发芽指数、活力指数均提高，种子线粒体中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase APX）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase GR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase MDHAR）和脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase DHAR）的活性均提高，还原型抗坏血酸（ascorbate ASC）/脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate DHA）和还原型谷胱甘肽（glutathione GSH）/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione GSSG）值增加。说明PEG引发处理增强了种子活力，提高了大豆种子抗吸胀冷害的能力。
关键词大豆种子；PEG；线粒体；抗氧化还原系统
中图分类号Q945.6 5文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）06-0135-02
许多栽培植物的种子在吸水萌动的初始阶段，如遇上低温易发生吸胀冷害，影响种子的出苗率和成活率，使幼苗的生长势下降，最终导致产量下降[1，2]。最早由Heydecker等提出通过种子引发来克服农业生产上遇到的种子冷害问题，且已证实具有显著作用。陶宗娅等认为发生吸胀冷害的要害是阻碍线粒体的正常发育，使其失去正常提供能量的功能[2，3]。同时Ana Jimenez等证实了线粒体中ASC-GSH的存在，以及ASC-GSH在非生物胁迫下的抗氧化胁迫作用[5，6]，说明该系统在抗性方面具有重要作用。因此，本文通过PEG引发处理后种子线粒体中抗氧化系统的变化与种子抗吸胀冷害能力的关系，以探讨其可能的耐寒机理，并为农业生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验以大豆[Glycine max（L.）Merr．]品种中黄22种子为试材，由中国农业科学院大豆研究所提供。
1.2材料的处理
1.2.1发芽试验。将种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃ 渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h）后，同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，随即进行发芽试验（25℃），检测PEG渗控对大豆种子抗吸胀冷害能力的影响。
1.2.2线粒体的提取。将种子进行同样的处理，于恒温培养箱培养48h后提取种子子叶中的线粒体，对线粒体中ASC-GSH抗氧化还原系统的成分进行测定，试验重复3次。
1.3种子发芽率及活力测定
发芽试验按《国际种子检验规程》（1996）进行，发芽床为12 cm培养皿加双层滤纸，用水湿润，每皿放25粒种子，3次重复。在HPG-280H人工气候箱内发芽，温度为25℃ ，光强为80μmoL/m2，记录发芽率及胚根干重。统计7d时的发芽率，发芽指数（GI）与活力指数（VI）按下式计算：GI=ΣGt／Dt；VI=GI×Sx。其中Gt为7d内种子每天的发芽个数，Dt为发芽天数，Sx为发芽7d时25粒种子胚根的总平均干物重。
1.4线粒体的提取及纯化
1.4.1提取[7]。大豆种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h），并同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，放于HPG-280H人工气候箱内培养48h后，取20g大豆种子子叶，将子叶放在盛有约35mL研磨介质中研磨成糊状。研磨介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH值8.0）、1mmol/L EDTA-Na2、0.1% BSA、1% PVP。匀浆用4层纱布过滤，滤液于1 000g离心10min，取其上清液10 000g离心15min，沉淀用20mL研磨介质洗涤，在10 000g下再次离心15min，将沉淀悬浮于1mL悬浮介质中即得到粗制线粒体悬浮液。悬浮介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值7.2）、1mmol/L EDTA-Na2、0.6% BSA。所有操作均在4℃下进行。
1.4.2纯化[7]。配制蔗糖梯度溶液，按由高到低的顺序将60%、52%、36%、20%的蔗糖溶液，依次铺入12mL透明管中室温放置1h后，将2mL粗制线粒体悬浮液平均铺于斜面上，100 000g 4℃水平离心50min（Beckman SW55），收集分层于36%~52%界面处的线粒体于试管中并置于冰上，小心滴加4倍体积的匀浆缓冲液（未加巯基乙醇和BSA）混匀后16 000g 4℃离心10min，沉淀即为纯化的线粒体。加入悬浮缓冲液后并放于液氮中速冻，于-80℃冷冻保存备用。
1.5线粒体检测
1.5.1光学显微镜观察。线粒体悬浮液与Janus GreenB应用液按1∶1比例混匀，室温染色15～20min，吸取适量线粒体悬液于载玻片上并加盖玻片后放于显微镜下进行观察。线粒体呈蓝绿色，椭圆形或卵圆形。
1.5.2完整性测定[9]。化学试剂5% Triton X-100能破碎完整线粒体，测定其在加入前后琥珀酸-细胞色素C还原酶活性，以加入前后酶活性之比来确定线粒体的完整度。反应介质中含有0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl和10 mmol/L磷酸缓冲液、5mmol/L MgCl2，5μmol/L细胞色素C和20mmol/L叠氮钠，在2.8mL反应介质中加入线粒体制备液0.1mL和200mmol/L琥珀酸钠溶液0.1mL后，测定550nm波长处光吸收值的变化。
1.6线粒体中抗氧化还原系统的测定
1.6.1抗氧化酶的提取和测定。参考Mittova等（2004）的方法测定APX、GR、MDHAR、DHAR和SOD的活性。
1.6.2抗氧化剂的提取和测定。在纯化后的线粒体中加入预冷的5%磺基水杨酸剧烈振荡，20 000g 4℃离心20 min，将上清液分装并放于液氮中速冻后，于-80℃保存或直接进行抗氧化剂分析。参考Jiang（2001）的方法测定ASA、DHA及ASA/DHA，参考Nagalakshmi（2001）的方法测定GSH、GSSG及GSH/GSSG。
2结果与分析
2.1PEG处理对大豆种子抗吸胀冷害能力的影响。从图1可知，PEG渗控12h后种子发芽指数明显上升，种子活力指数在渗控处理12h后上升较快，随着渗控时间的延长，还呈逐渐上升趋势。表明引发处理可增强大豆种子抵抗吸胀冷害的能力。
2.2线粒体检测
2.2.1光学显微镜下观察。经Janus GreenB染色后，在光学显微镜中可见蓝绿色卵圆形和椭圆形颗粒，证明是线粒体。
2.2.2完整性分析。从表1可知，经过PEG引发处理不同时间后，线粒体具有很好的完整度。其中引发处理12h后完整度达92.7%，是完整度最高的；而处理24h后线粒体的完整度为89.7%，也接近90%。
2.3.3PEG处理对种子线粒体中脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的影响。随着引发时间的延长，DHAR和MDHAR的活性逐渐增强（图2）；引发处理12h时DHAR的活性增加了40.83%，而MDHAR的活性增加了6.71%；当引发处理72h时，DHAR的活性比12h时增加了35.66%，MDHAR的活性比12h时增加了51.18%。
2.3.4PEG处理对种子线粒体中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。经PEG引发处理后SOD的活性均明显高于对照（图2），处理72h时SOD的活性比对照增加了58.94%，比引发12h时增加了23.33%。SOD作为植物线粒体对氧化胁迫防御策略的第二道防线，一旦活性氧（ROS）生成，O2在SOD催化下转变成O2和H2O2。SOD活性的增强使活性氧（ROS）得到了有效清除，减少了氧胁迫的伤害，提高了种子抗吸胀冷害的能力。
2.4PEG处理对大豆种子线粒体中抗氧化物的影响
随着引发时间的延长，单个抗氧化物分子含量变化不明显（表2），但是还原型和氧化型的比随着引发时间的延长在逐渐增大。小分子抗氧化物的存在，对处于不良环境的种子起到了很好的保护作用。
3结论
试验结果表明，PEG引发处理可以提高种子活力，增强种子中各种抗氧化酶的活性，从而增强种子抵抗吸胀冷害的能力，对于农业生产中遇到的种子吸胀冷害问题，提供了可供解决的途径。
4参考文献
[1] HEYDECKER W，HIGGINS J，GULLIVER R L.Accelerated germin-ation by osmotic seed treatment[J].Nature，1973（246）：42-44.
[2] 陶宗娅，邹琦.种子的吸胀冷害和吸胀伤害[J].植物生理学通讯，2000，36（4）：368-376.
[3] ANA JIMENEZ，JOSE A HERNANDEZ，GABRIELA PASTORI，et al.Role of the Ascorbate-Glutathione Cycle of Mitochondria and Pero-xisomes in the Senescenxe of Pea Leaves[J].Plant Physiol，1998（118）：1327-1335.
[4] JIMENEZ A，HERNANDEZ J A，DELRIO L A，et al.Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and pero-xisomes of pea leaves[J].Plant Physiol，1997（114）：275-284.
[5] NAGALAKSHMI N，PRASAD MNV.Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmus bijugatus[J].Plant Sci.，2001（160）：291-199.
[6] BARTOLI C G，GOMEZ F，MARTINEZ D E，et al.Mitochondria are the main target for oxidative damage in leavesof wheat（Triticum aestivum L.）[J].J. Exp. Bot.，2004（55）：1663-1669.
[7] MAXWELL D P，WANG Y，MCINTOSH L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen productionIn plant cells[J].Proc.Natl. Acad. Sci.，USA，1999（96）：8271-8276.
[8] 杨素铀，王秀春，辛化伟，等.绿豆子叶衰老过程中线粒体膜对几种氨基酸的透性[J].自然科学，1995（1）：24-29.
[9] MITTOVA V，VOLOKITA M，GUY M，et al. Activities of SOD and the ascorbate-glutathione cydle enzymes in subcellular compartments in leaves and roots of the cultivated tomato and its wild salt-tolerane relative Lycopersiconpennellii[J]. Physiologia Plantarum，2000（110）：42-51.
[10] JIANG M Y，ZHANG J H.Effect of abscisic acid on ac-tive oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of Maize seedlings[J].Plant Cell Physiol，2001（42）：1265-1273.
[11] VALENTINA MITTOVA，MICHA G M T，MICHA VOLOKITA.Salinity up-regulates the antioxidative system in root motochondria and peroxisomes of the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii[J].Journal of Experimental Botany，2004（55）：1105-1113.
关键词大豆种子；PEG；线粒体；抗氧化还原系统
中图分类号Q945.6 5文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）06-0135-02
许多栽培植物的种子在吸水萌动的初始阶段，如遇上低温易发生吸胀冷害，影响种子的出苗率和成活率，使幼苗的生长势下降，最终导致产量下降[1，2]。最早由Heydecker等提出通过种子引发来克服农业生产上遇到的种子冷害问题，且已证实具有显著作用。陶宗娅等认为发生吸胀冷害的要害是阻碍线粒体的正常发育，使其失去正常提供能量的功能[2，3]。同时Ana Jimenez等证实了线粒体中ASC-GSH的存在，以及ASC-GSH在非生物胁迫下的抗氧化胁迫作用[5，6]，说明该系统在抗性方面具有重要作用。因此，本文通过PEG引发处理后种子线粒体中抗氧化系统的变化与种子抗吸胀冷害能力的关系，以探讨其可能的耐寒机理，并为农业生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验以大豆[Glycine max（L.）Merr．]品种中黄22种子为试材，由中国农业科学院大豆研究所提供。
1.2材料的处理
1.2.1发芽试验。将种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃ 渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h）后，同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，随即进行发芽试验（25℃），检测PEG渗控对大豆种子抗吸胀冷害能力的影响。
1.2.2线粒体的提取。将种子进行同样的处理，于恒温培养箱培养48h后提取种子子叶中的线粒体，对线粒体中ASC-GSH抗氧化还原系统的成分进行测定，试验重复3次。
1.3种子发芽率及活力测定
发芽试验按《国际种子检验规程》（1996）进行，发芽床为12 cm培养皿加双层滤纸，用水湿润，每皿放25粒种子，3次重复。在HPG-280H人工气候箱内发芽，温度为25℃ ，光强为80μmoL/m2，记录发芽率及胚根干重。统计7d时的发芽率，发芽指数（GI）与活力指数（VI）按下式计算：GI=ΣGt／Dt；VI=GI×Sx。其中Gt为7d内种子每天的发芽个数，Dt为发芽天数，Sx为发芽7d时25粒种子胚根的总平均干物重。
1.4线粒体的提取及纯化
1.4.1提取[7]。大豆种子置于33%（W／V）PEG 6 000水溶液中，于25℃渗控不同时间（0h、12h、24h、48h、72h），并同时置于4℃冰水中低温吸胀24h，放于HPG-280H人工气候箱内培养48h后，取20g大豆种子子叶，将子叶放在盛有约35mL研磨介质中研磨成糊状。研磨介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH值8.0）、1mmol/L EDTA-Na2、0.1% BSA、1% PVP。匀浆用4层纱布过滤，滤液于1 000g离心10min，取其上清液10 000g离心15min，沉淀用20mL研磨介质洗涤，在10 000g下再次离心15min，将沉淀悬浮于1mL悬浮介质中即得到粗制线粒体悬浮液。悬浮介质的成分为：0.4mol/L蔗糖、50mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值7.2）、1mmol/L EDTA-Na2、0.6% BSA。所有操作均在4℃下进行。
1.4.2纯化[7]。配制蔗糖梯度溶液，按由高到低的顺序将60%、52%、36%、20%的蔗糖溶液，依次铺入12mL透明管中室温放置1h后，将2mL粗制线粒体悬浮液平均铺于斜面上，100 000g 4℃水平离心50min（Beckman SW55），收集分层于36%~52%界面处的线粒体于试管中并置于冰上，小心滴加4倍体积的匀浆缓冲液（未加巯基乙醇和BSA）混匀后16 000g 4℃离心10min，沉淀即为纯化的线粒体。加入悬浮缓冲液后并放于液氮中速冻，于-80℃冷冻保存备用。
1.5线粒体检测
1.5.1光学显微镜观察。线粒体悬浮液与Janus GreenB应用液按1∶1比例混匀，室温染色15～20min，吸取适量线粒体悬液于载玻片上并加盖玻片后放于显微镜下进行观察。线粒体呈蓝绿色，椭圆形或卵圆形。
1.5.2完整性测定[9]。化学试剂5% Triton X-100能破碎完整线粒体，测定其在加入前后琥珀酸-细胞色素C还原酶活性，以加入前后酶活性之比来确定线粒体的完整度。反应介质中含有0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl和10 mmol/L磷酸缓冲液、5mmol/L MgCl2，5μmol/L细胞色素C和20mmol/L叠氮钠，在2.8mL反应介质中加入线粒体制备液0.1mL和200mmol/L琥珀酸钠溶液0.1mL后，测定550nm波长处光吸收值的变化。
1.6线粒体中抗氧化还原系统的测定
1.6.1抗氧化酶的提取和测定。参考Mittova等（2004）的方法测定APX、GR、MDHAR、DHAR和SOD的活性。
1.6.2抗氧化剂的提取和测定。在纯化后的线粒体中加入预冷的5%磺基水杨酸剧烈振荡，20 000g 4℃离心20 min，将上清液分装并放于液氮中速冻后，于-80℃保存或直接进行抗氧化剂分析。参考Jiang（2001）的方法测定ASA、DHA及ASA/DHA，参考Nagalakshmi（2001）的方法测定GSH、GSSG及GSH/GSSG。
2结果与分析
2.1PEG处理对大豆种子抗吸胀冷害能力的影响。从图1可知，PEG渗控12h后种子发芽指数明显上升，种子活力指数在渗控处理12h后上升较快，随着渗控时间的延长，还呈逐渐上升趋势。表明引发处理可增强大豆种子抵抗吸胀冷害的能力。
2.2线粒体检测
2.2.1光学显微镜下观察。经Janus GreenB染色后，在光学显微镜中可见蓝绿色卵圆形和椭圆形颗粒，证明是线粒体。
2.2.2完整性分析。从表1可知，经过PEG引发处理不同时间后，线粒体具有很好的完整度。其中引发处理12h后完整度达92.7%，是完整度最高的；而处理24h后线粒体的完整度为89.7%，也接近90%。
2.3.3PEG处理对种子线粒体中脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）活性和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性的影响。随着引发时间的延长，DHAR和MDHAR的活性逐渐增强（图2）；引发处理12h时DHAR的活性增加了40.83%，而MDHAR的活性增加了6.71%；当引发处理72h时，DHAR的活性比12h时增加了35.66%，MDHAR的活性比12h时增加了51.18%。
2.3.4PEG处理对种子线粒体中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响。经PEG引发处理后SOD的活性均明显高于对照（图2），处理72h时SOD的活性比对照增加了58.94%，比引发12h时增加了23.33%。SOD作为植物线粒体对氧化胁迫防御策略的第二道防线，一旦活性氧（ROS）生成，O2在SOD催化下转变成O2和H2O2。SOD活性的增强使活性氧（ROS）得到了有效清除，减少了氧胁迫的伤害，提高了种子抗吸胀冷害的能力。
2.4PEG处理对大豆种子线粒体中抗氧化物的影响
随着引发时间的延长，单个抗氧化物分子含量变化不明显（表2），但是还原型和氧化型的比随着引发时间的延长在逐渐增大。小分子抗氧化物的存在，对处于不良环境的种子起到了很好的保护作用。
3结论
试验结果表明，PEG引发处理可以提高种子活力，增强种子中各种抗氧化酶的活性，从而增强种子抵抗吸胀冷害的能力，对于农业生产中遇到的种子吸胀冷害问题，提供了可供解决的途径。
4参考文献
[1] HEYDECKER W，HIGGINS J，GULLIVER R L.Accelerated germin-ation by osmotic seed treatment[J].Nature，1973（246）：42-44.
[2] 陶宗娅，邹琦.种子的吸胀冷害和吸胀伤害[J].植物生理学通讯，2000，36（4）：368-376.
[3] ANA JIMENEZ，JOSE A HERNANDEZ，GABRIELA PASTORI，et al.Role of the Ascorbate-Glutathione Cycle of Mitochondria and Pero-xisomes in the Senescenxe of Pea Leaves[J].Plant Physiol，1998（118）：1327-1335.
[4] JIMENEZ A，HERNANDEZ J A，DELRIO L A，et al.Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and pero-xisomes of pea leaves[J].Plant Physiol，1997（114）：275-284.
[5] NAGALAKSHMI N，PRASAD MNV.Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmus bijugatus[J].Plant Sci.，2001（160）：291-199.
[6] BARTOLI C G，GOMEZ F，MARTINEZ D E，et al.Mitochondria are the main target for oxidative damage in leavesof wheat（Triticum aestivum L.）[J].J. Exp. Bot.，2004（55）：1663-1669.
[7] MAXWELL D P，WANG Y，MCINTOSH L. The alternative oxidase lowers mitochondrial reactive oxygen productionIn plant cells[J].Proc.Natl. Acad. Sci.，USA，1999（96）：8271-8276.
[8] 杨素铀，王秀春，辛化伟，等.绿豆子叶衰老过程中线粒体膜对几种氨基酸的透性[J].自然科学，1995（1）：24-29.
[9] MITTOVA V，VOLOKITA M，GUY M，et al. Activities of SOD and the ascorbate-glutathione cydle enzymes in subcellular compartments in leaves and roots of the cultivated tomato and its wild salt-tolerane relative Lycopersiconpennellii[J]. Physiologia Plantarum，2000（110）：42-51.
[10] JIANG M Y，ZHANG J H.Effect of abscisic acid on ac-tive oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of Maize seedlings[J].Plant Cell Physiol，2001（42）：1265-1273.
[11] VALENTINA MITTOVA，MICHA G M T，MICHA VOLOKITA.Salinity up-regulates the antioxidative system in root motochondria and peroxisomes of the wild salt-tolerant tomato species Lycopersicon pennellii[J].Journal of Experimental Botany，2004（55）：1105-1113.