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摘要 黄瓜绿斑驳花叶病毒 Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）是葫芦科作物的重要检疫性病毒。本研究以田间自然感病的西瓜叶片为试材，采用RTPCR获得该病毒（CGMMVLNYK）基因组全长（登录号MG745849），以pBluescript Ⅱ SK（）为载体，分别克隆其所编码的4段基因，并采用人工接种验证它们的体外侵染活性。结果表明：该病毒与韩国分离物KW（登录号AF417242）亲缘关系最近，相似度达99.8%，并成功克隆了CGMMVLNYK编码的4段基因，分别记为RNA1～RNA4。经人工接种，发现RNA1和RNA4能侵染葫芦，表现明显花叶症状，与该病毒接种葫芦症状一致，且接种RNA1后的症状较RNA4明显，4种RNA混合接种症状最为明显，经RTPCR检测，发病植株可扩增到与接种的RNA大小相等的片段。
关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒; 基因组全长; 克隆
中图分类号： S 436.421
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018222
Abstract Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus of cucurbits. In this study， the complete nucleotide sequence of the virus （GenBank accession no. MG745849） was obtained by RTPCR in the naturally infected watermelon leaves. The four gene fragments encoded by the CGMMV were cloned into pBluescript Ⅱ SK（） containing T7 promoter， respectively， and the invasive activity in vitro was verified by artificial inoculation. The results showed that the CGMMV was most closely related to the KW （GenBank accession no. AF417242） isolated from Korea， with an identity of 99.8%. The 4 infectious gene fragments of the CGMMV were successfully constructed and the segments RNA1 and RNA4 could infect cucurbits and cause obvious systemic mosaic in leaves. Moreover， the symptoms caused by the segment RNA1 were more severe than those by RNA4 after artificial inoculation. The symptoms were most obvious when the four segments of RNA inoculated at the same time. The RNA fragment amplified in diseased plants was equal in length to the inoculated viral RNA by RTPCR.
Key words Cucumber green mottle mosaic virus; full length of genome; clone
黃瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）是葫芦科作物的重要病毒，西瓜感染该病毒后植株生长缓慢，果实内部严重变色或腐烂，果肉纤维化、水渍状，严重时丧失食用价值，俗称西瓜倒瓤病或血瓤病[1]。CGMMV给葫芦科作物生产带来严重影响，1998年在韩国大面积暴发，造成463 hm2绝收[2];2004年在巴基斯坦部分地区葫芦科作物发病率达46.9%[3];2005年中国辽宁省盖州市由于种子带毒而导致西瓜大面积感染CGMMV，发生面积333 hm2，其中13 hm2绝收[4]，引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。根据我国农业部公布的《全国农业植物检疫性有害生物分布行政区名录（2014）》，辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、山东、湖北、湖南、广东、广西、海南等11个省市区74个县市区均有CGMMV分布。迄今对于该病毒的致病机理研究多集中在生理生化水平，Adzhemyan等研究认为黄瓜感染该病毒后可导致植株体内可溶性糖和游离氨基酸含量的积累[5];Srivastava等研究表明该病毒可通过影响磷酸戊糖途径，导致多酚氧化酶活性发生改变，进而导致酚类物质积累[6]。本研究首先测定了CGMMV国内首发区的基因组全长序列，然后依据全基因组序列分别克隆了该病毒编码的4段基因，旨在找到可侵染寄主植物的基因，为今后该病科学有效的防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试毒原及载体
自然感病的西瓜植株采自辽宁省营口市，田间表现症状为叶片斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑，经RTPCR检测，定名为CGMMVLNYK，采用汁液摩擦法繁殖保存在防虫温室的葫芦上;侵染性克隆载体为pBluescript Ⅱ SK（）载体。
1.1.2 试剂
TRIzol试剂购自Invitrogen;LA Taq Polymerase、pMD18T simple vector、感受态细胞DH5α、限制性内切酶Not Ⅰ和Xho Ⅰ、TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit （Code No.D6110A）、TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit （Code No. DR027A）、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase （Code No. DR010S）、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Code No. DV805A）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、TaKaRa in vitro Transcription T7 Kit （Code No. D6140）、TaKaRa DNA Ligation Kit
关键词 黄瓜绿斑驳花叶病毒; 基因组全长; 克隆
中图分类号： S 436.421
文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018222
Abstract Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV） is an important quarantine virus of cucurbits. In this study， the complete nucleotide sequence of the virus （GenBank accession no. MG745849） was obtained by RTPCR in the naturally infected watermelon leaves. The four gene fragments encoded by the CGMMV were cloned into pBluescript Ⅱ SK（） containing T7 promoter， respectively， and the invasive activity in vitro was verified by artificial inoculation. The results showed that the CGMMV was most closely related to the KW （GenBank accession no. AF417242） isolated from Korea， with an identity of 99.8%. The 4 infectious gene fragments of the CGMMV were successfully constructed and the segments RNA1 and RNA4 could infect cucurbits and cause obvious systemic mosaic in leaves. Moreover， the symptoms caused by the segment RNA1 were more severe than those by RNA4 after artificial inoculation. The symptoms were most obvious when the four segments of RNA inoculated at the same time. The RNA fragment amplified in diseased plants was equal in length to the inoculated viral RNA by RTPCR.
Key words Cucumber green mottle mosaic virus; full length of genome; clone
黃瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus（CGMMV）是葫芦科作物的重要病毒，西瓜感染该病毒后植株生长缓慢，果实内部严重变色或腐烂，果肉纤维化、水渍状，严重时丧失食用价值，俗称西瓜倒瓤病或血瓤病[1]。CGMMV给葫芦科作物生产带来严重影响，1998年在韩国大面积暴发，造成463 hm2绝收[2];2004年在巴基斯坦部分地区葫芦科作物发病率达46.9%[3];2005年中国辽宁省盖州市由于种子带毒而导致西瓜大面积感染CGMMV，发生面积333 hm2，其中13 hm2绝收[4]，引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。根据我国农业部公布的《全国农业植物检疫性有害生物分布行政区名录（2014）》，辽宁、上海、江苏、浙江、安徽、山东、湖北、湖南、广东、广西、海南等11个省市区74个县市区均有CGMMV分布。迄今对于该病毒的致病机理研究多集中在生理生化水平，Adzhemyan等研究认为黄瓜感染该病毒后可导致植株体内可溶性糖和游离氨基酸含量的积累[5];Srivastava等研究表明该病毒可通过影响磷酸戊糖途径，导致多酚氧化酶活性发生改变，进而导致酚类物质积累[6]。本研究首先测定了CGMMV国内首发区的基因组全长序列，然后依据全基因组序列分别克隆了该病毒编码的4段基因，旨在找到可侵染寄主植物的基因，为今后该病科学有效的防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试毒原及载体
自然感病的西瓜植株采自辽宁省营口市，田间表现症状为叶片斑驳、花叶、叶脉绿带状、浓绿凹凸斑，经RTPCR检测，定名为CGMMVLNYK，采用汁液摩擦法繁殖保存在防虫温室的葫芦上;侵染性克隆载体为pBluescript Ⅱ SK（）载体。
1.1.2 试剂
TRIzol试剂购自Invitrogen;LA Taq Polymerase、pMD18T simple vector、感受态细胞DH5α、限制性内切酶Not Ⅰ和Xho Ⅰ、TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit （Code No.D6110A）、TaKaRa High Fidelity PrimeScriptTM RTPCR Kit （Code No. DR027A）、TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Polymerase （Code No. DR010S）、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 （Code No. DV805A）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0、TaKaRa in vitro Transcription T7 Kit （Code No. D6140）、TaKaRa DNA Ligation Kit