论文部分内容阅读
摘要 [目的]了解沅水五强溪水库引进外来物种斑点叉尾鮰的体细胞染色体组型。[方法] 采用植物血球凝集素和秋水仙素胸腔注射，取活体肾细胞低渗、固定、火焰干燥法制作染色体标本，对沅水五强溪水库引进外来物种斑点叉尾鮰的染色体核型进行分析。[结果] 斑点叉尾鮰中期染色体二倍体数为2N = 58，染色体配成29对，其中中部着丝点染色体4对，亚中部着丝点染色体5对，亚端部着丝点染色体13对，端部着丝点染色体7对。核型公式为2N = 8M+10SM+26ST+14T，染色体臂数（NF）= 76。[结论] 该研究可为洞庭湖区斑点叉尾鮰的种质资源保护、遗传育种改良提供参考依据，也为进一步探讨引进外来种对本地相近物种的遗传多样性影响提供基础性资料。
关键词 斑点叉尾鮰；引进外来物种；五强溪水库；染色体组型
中图分类号 S965.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0099-02
Karyotype Analysis of Ictalurus punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River
LIU Zhe-tong1， LIU Liang-guo2*
（1.Changde Zhilan Experimental School， Changde， Hunan 415000；2.College of Life and Environmental Sciences， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000）
Abstract [Objective] To understand the somatic cells karyotype of introduced alien species Ictalurus punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River.[Method] After intrapleural injection of phytohemagglutinin （PHA） and colchicine， live renal cells were sampled to make chromosome specimen by low-permeability， fixation and flame-drying technique.The karyotype of introduced alien species I.punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River were analyzed.[Result] The diploid number（2N） of metaphase chromosomes in I.punctatus was 58， which matched 29 pairs of chromosomes， including 4 pairs of metacentric chromosomes， 5 pairs of submetacentric chromosomes， 13 pairs of subtelocentric and 7 pairs of telocentric chromosomes.The karyotype formula of I.punctatus was 2N=8M+10SM+26ST+14T，NF=76.[Conclusion] The research can provide references for germplasm resources’ protection and genetic improvement and basic data for further discussion on the effects of introduced alien species I.punctatus on the genetic diversity of local similar species.
Key words Ictalurus punctatus；Introduced alien species；Wuqiangxi Reservoir；Karyotype
斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又称沟鲶，隶属鲇形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluridae）鮰属（Ictalurus）[1]，原产于北美洲，是一种大型淡水经济鱼类，具有食性杂、生长快、适应范围广、抗逆性强、肉质鲜美等优点。我国于1984年由湖北省水产科学研究所从美国引进该鱼进行原种驯化，并于1987年首次繁育成功[2]，于20世纪90年代末引入湖南，并率先在沅水五强溪水库进行网箱养殖示范，发展网箱规模化养殖[3]。经过多年的养殖推广，目前斑点叉尾鮰已遍及我国20多个省、市、自治区，成为我国重要的淡水养殖鱼类之一。然而，由于引进后多年的累代养殖、人为的近亲繁殖、养殖技术不规范等原因，导致斑点叉尾鮰的种质退化严重，主要表现为抗病力下降、生长缓慢和规格变小，高密度集约化养殖时容易发生大规模病害和死亡，这些问题严重制约了斑点叉尾鮰的养殖发展[4]。为了进一步提高养殖斑点叉尾鮰的质量和产量，确保鮰鱼养殖业的可持续发展，开展斑点叉尾鮰种质资源保护和遗传育种改良的研究具有重要的理论和实践指导意义。同时，近年来由于网箱养殖逃逸或人为因素导致一些斑点叉尾鮰进入天然水体，有可能与本地相近物种进行杂交，从而对本地物种构成遗传侵蚀。因此，有必要对引进外来物种斑点叉尾鮰的遗传学特性开展研究。笔者以取自湖南沅水五强溪水库的斑点叉尾鮰为研究对象，对其染色体组型进行了分析，旨在了解五强溪水库引进外来物种斑点叉尾鮰的染色体核型，为斑点叉尾鮰的种质资源保护和遗传育种改良提供参考依据，也为进一步探讨引进外来种对本地相近物种遗传多样性的影响提供基础性资料。 1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用鱼取自沅水五强溪水库，随机选取健康活泼的斑点叉尾鮰6尾（3♀、3♂），体长13.10～21.04 cm，体重为230～320 g。将试验鱼放入室内水族箱（温度控制在21～24 ℃）中暂养1 d后，开始试验。
1.2 方法
1.2.1 肾细胞染色体标本的制备。
染色体标本的制作方法参照刘良国等[5]肾细胞染色体标本的制备方法并加以改进，具体操作步骤如下：试验前1 d进行腹腔注射植物血球凝集素（PHA），12 h后再次进行PHA腹腔注射，2次注射剂量分别为10和8 μg/g，第2次注射PHA溶液4.5 h后，按2 μg/g的剂量注射秋水仙素，1.5～2.0 h后取材；将试验鱼剪鳃失血10 min，解剖取出肾脏（头肾）放入盛有生理盐水的培养皿中清洗干净，剔除脂肪组织和血块；剪碎，吸入10 mL离心管，用吸管充分吹打（100次以上）；吸入生理盐水，混合均匀，静置 5 min 后，吸取上层细胞悬液置于另1个离心管中；离心后的细胞沉淀用0.075 mol/L KCl液低渗处理，卡诺氏液固定，换液3次；采用火焰干燥方法制片，用Giemsa染液染色，玻片反面用微流水冲洗，室温下晾干后，获得6尾斑点叉尾鮰的染色体玻片标本。
1.2.2 染色体数目统计及核型分析。
在光学显微镜下对斑点叉尾鮰的染色体玻片标本进行观察，油镜下选择50个分散良好、形态清晰的中期分裂相，使用显微数码成像系统进行逐一拍照，使用Photoshop软件计数每个分裂相的染色体数目，并统计染色体众数分布；选取10个染色体完整、分散良好、形态清晰的中期分裂相，放大打印后剪下打印纸上中期分裂相的每条染色体，测量其全长、短臂长和长臂长，计算其相对长度和臂比，得到斑點叉尾鮰染色体对的核型数据，根据核型数据并参照Levan等[6]的染色体分组标准进行核型分析。
2 结果与分析
2.1 五强溪水库斑点叉尾鮰体细胞染色体数目
由表1可知，计数6尾斑点叉尾鮰的中期分裂相共50个，染色体数目分别在55以下、55、60和60以上的各有1个细胞，染色体数目为56、59的各有2个细胞，染色体数目为58的有39个细胞，染色体数目为57的有3个细胞。染色体数目为58的占计数细胞总数的78%，众数百分率高于75%的常规标准，因此确定五强溪水库斑点叉尾鮰的标准染色体数目2N = 58（图1）。在斑点叉尾鮰的雌、雄个体间未发现与性别有关的异形性染色体，也未发现带有特殊标志性特征（如随体、次缢痕）的染色体。
2.2 五强溪水库斑点叉尾鮰的染色体组型
根据染色体相对长度和臂比值的测量结果（表2），将斑点叉尾鮰的全部染色体配成29对，参照Levan命名法[6]，五强溪水库斑点叉尾鮰的核型由4对中部着丝点染色体、5对亚中部着丝点染色体、13对亚端部着丝点染色体和7对端部着丝点染色体组成（图2），核型公式为2N = 8M+10 SM+26 ST+14 T，染色体臂数（NF）= 76。
3 讨论与结论
斑点叉尾鮰自1984年从美国引进至今已有30多年的历史，由于它具有较高的养殖经济效益，目前在国内许多地区的水库、池塘中都有养殖。该试验以沅水五强溪水库的斑点叉尾鮰为研究对象，对其体细胞染色体组型进行了研究。
结果表明，五强溪水库斑点叉尾鮰的二倍体染色体数目为58，核型公式为2N=8M+10SM+26ST+14T，染色体臂数（NF）= 76，与张芹等[7]报道的河南省水产科学研究院引进的斑点叉尾鮰进行比较，发现二者的染色体数目均为58，但核型存在一定差异，河南斑点叉尾鮰种群的核型公式为2N=6M+10SM+22ST+20T，NF=74。该研究中沅水五强溪水库斑点叉尾鮰的M和ST染色体比河南种群分别多1对和2对，SM染色体不变，T染色体减少3对，染色体总臂数增加2条。造成这种差异的原因，可能与不同研究者使用的试验方法不同，或者与测量和配组产生的误差有关；但也可能是由于不同种群所表现出的染色体多态性所造成的。张芹等[7]报道国内引进的斑点叉尾鮰大多来自于美国的德克萨斯州、阿拉巴马州、密西西比州等地理种群，其染色体数目为56或58，染色体臂数为72、90或92不等，染色体组型也不尽相同。刘海韵等[8]和崔蕾等[9]采用分子生物学方法也证实了斑点叉尾鮰不同地理种群的遗传差异和多样性。斑点叉尾鮰种群丰富的遗传多样性，为这一养殖品种的资源保护和遗传改良提供了物质基础，利用这些遗传多样性丰富的群体进行杂交选育，生产上可以避免种质的退化，保证我国斑点叉尾鮰养殖业的健康可持续发展。
斑点叉尾鮰作为一种引进的外来养殖品种，在带来较高经济效益的同时，亦可能给当地生态安全造成影响。由于斑点叉尾鮰食性杂、抗逆性强、适应范围广，像五强溪水库这样的水面资源和天然饵料丰富的水域生态系统，非常适合斑点叉尾鮰的生长，若不加以人为控制，其种群数量将会大幅增加，除了与本地鱼种争夺生存空间，导致本地土著鱼种和数量的急剧减少外，还可能与本地近缘种进行杂交，杂交后代再与本地其他近缘种杂交而造成遗传侵蚀[2，10]。该试验中斑点叉尾鮰的染色体数目与同属于鲇形目的本地鲇[11]、大口鲇[12]的染色体数目相同（均为58），虽然核型上存在差异，但在天然水体中如果长期共存，不排除它们存在科间杂交并产生可繁育子代的可能性。因此，对于网箱和池塘养殖或者已经逃逸到天然水体的斑点叉尾鮰，都必须采取相应的强有力措施，严防其向天然水体大量扩散，避免对本地鱼种的遗传污染。
参考文献
[1] 刘良国，杨春英，杨品红，等.湖南境内沅水鱼类资源现状与多样性分析[J].海洋与湖沼，2013，44（1）：148-158.
[2] 卜跃先，谢初昀，刘鑫宇，等.引进外来物种的环境风险评价初探：以美国斑点叉尾鮰为例[J].水利渔业，2008，28（1）：82-84.
[3] 麻韶霖.华中斑点叉尾鮰产业发展走势分析[J].当代水产，2012（1）：42-44.
[4] 周国平.中国斑点叉尾鮰产业的现状及发展建议[J].中国水产，2005（6）：26-28.
[5] 刘良国，赵俊，崔淼，等.尖鳍鲤的染色体组型分析[J].华南师范大学学报（自然科学版），2004（1）：108-111.
[6] LEVAN A，TREDGA K，SANDBERG A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes [J].Heredita，1964，52（2）：201-220.
[7] 张芹，宋威，惠筠，等.斑点叉尾鮰染色体组型的研究[J].河南水产，2009（1）：35-36.
[8] 刘海韵，周勤洁，雷靖靖，等.不同地区斑点叉尾鮰种内遗传多样性分析[J].氨基酸和生物资源，2008，30（4）：1-6.
[9] 崔蕾，谢从新，李艳和，等.斑点叉尾鮰4个群体遗传多样性的微卫星分析[J].华中农业大学学报，2012，31（6）：744-751.
[10] 楼允东，李小勤.中国鱼类远缘杂交研究及其在水产养殖上的应用[J].中国水产科学，2006，13（1）：151-158.
[11] 韩庆，秦杰，席在星.洞庭湖土鲶染色体核型分析[J].水产科学，2009，28（8）：462-464.
[12] 邹桂伟，潘光碧，梁拥军，等.大口鲇染色体组型和DNA含量的研究[J].中国水产科学，1997，4（5）：96-99.
关键词 斑点叉尾鮰；引进外来物种；五强溪水库；染色体组型
中图分类号 S965.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0099-02
Karyotype Analysis of Ictalurus punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River
LIU Zhe-tong1， LIU Liang-guo2*
（1.Changde Zhilan Experimental School， Changde， Hunan 415000；2.College of Life and Environmental Sciences， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000）
Abstract [Objective] To understand the somatic cells karyotype of introduced alien species Ictalurus punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River.[Method] After intrapleural injection of phytohemagglutinin （PHA） and colchicine， live renal cells were sampled to make chromosome specimen by low-permeability， fixation and flame-drying technique.The karyotype of introduced alien species I.punctatus in Wuqiangxi Reservoir of Yuanshui River were analyzed.[Result] The diploid number（2N） of metaphase chromosomes in I.punctatus was 58， which matched 29 pairs of chromosomes， including 4 pairs of metacentric chromosomes， 5 pairs of submetacentric chromosomes， 13 pairs of subtelocentric and 7 pairs of telocentric chromosomes.The karyotype formula of I.punctatus was 2N=8M+10SM+26ST+14T，NF=76.[Conclusion] The research can provide references for germplasm resources’ protection and genetic improvement and basic data for further discussion on the effects of introduced alien species I.punctatus on the genetic diversity of local similar species.
Key words Ictalurus punctatus；Introduced alien species；Wuqiangxi Reservoir；Karyotype
斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又称沟鲶，隶属鲇形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluridae）鮰属（Ictalurus）[1]，原产于北美洲，是一种大型淡水经济鱼类，具有食性杂、生长快、适应范围广、抗逆性强、肉质鲜美等优点。我国于1984年由湖北省水产科学研究所从美国引进该鱼进行原种驯化，并于1987年首次繁育成功[2]，于20世纪90年代末引入湖南，并率先在沅水五强溪水库进行网箱养殖示范，发展网箱规模化养殖[3]。经过多年的养殖推广，目前斑点叉尾鮰已遍及我国20多个省、市、自治区，成为我国重要的淡水养殖鱼类之一。然而，由于引进后多年的累代养殖、人为的近亲繁殖、养殖技术不规范等原因，导致斑点叉尾鮰的种质退化严重，主要表现为抗病力下降、生长缓慢和规格变小，高密度集约化养殖时容易发生大规模病害和死亡，这些问题严重制约了斑点叉尾鮰的养殖发展[4]。为了进一步提高养殖斑点叉尾鮰的质量和产量，确保鮰鱼养殖业的可持续发展，开展斑点叉尾鮰种质资源保护和遗传育种改良的研究具有重要的理论和实践指导意义。同时，近年来由于网箱养殖逃逸或人为因素导致一些斑点叉尾鮰进入天然水体，有可能与本地相近物种进行杂交，从而对本地物种构成遗传侵蚀。因此，有必要对引进外来物种斑点叉尾鮰的遗传学特性开展研究。笔者以取自湖南沅水五强溪水库的斑点叉尾鮰为研究对象，对其染色体组型进行了分析，旨在了解五强溪水库引进外来物种斑点叉尾鮰的染色体核型，为斑点叉尾鮰的种质资源保护和遗传育种改良提供参考依据，也为进一步探讨引进外来种对本地相近物种遗传多样性的影响提供基础性资料。 1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用鱼取自沅水五强溪水库，随机选取健康活泼的斑点叉尾鮰6尾（3♀、3♂），体长13.10～21.04 cm，体重为230～320 g。将试验鱼放入室内水族箱（温度控制在21～24 ℃）中暂养1 d后，开始试验。
1.2 方法
1.2.1 肾细胞染色体标本的制备。
染色体标本的制作方法参照刘良国等[5]肾细胞染色体标本的制备方法并加以改进，具体操作步骤如下：试验前1 d进行腹腔注射植物血球凝集素（PHA），12 h后再次进行PHA腹腔注射，2次注射剂量分别为10和8 μg/g，第2次注射PHA溶液4.5 h后，按2 μg/g的剂量注射秋水仙素，1.5～2.0 h后取材；将试验鱼剪鳃失血10 min，解剖取出肾脏（头肾）放入盛有生理盐水的培养皿中清洗干净，剔除脂肪组织和血块；剪碎，吸入10 mL离心管，用吸管充分吹打（100次以上）；吸入生理盐水，混合均匀，静置 5 min 后，吸取上层细胞悬液置于另1个离心管中；离心后的细胞沉淀用0.075 mol/L KCl液低渗处理，卡诺氏液固定，换液3次；采用火焰干燥方法制片，用Giemsa染液染色，玻片反面用微流水冲洗，室温下晾干后，获得6尾斑点叉尾鮰的染色体玻片标本。
1.2.2 染色体数目统计及核型分析。
在光学显微镜下对斑点叉尾鮰的染色体玻片标本进行观察，油镜下选择50个分散良好、形态清晰的中期分裂相，使用显微数码成像系统进行逐一拍照，使用Photoshop软件计数每个分裂相的染色体数目，并统计染色体众数分布；选取10个染色体完整、分散良好、形态清晰的中期分裂相，放大打印后剪下打印纸上中期分裂相的每条染色体，测量其全长、短臂长和长臂长，计算其相对长度和臂比，得到斑點叉尾鮰染色体对的核型数据，根据核型数据并参照Levan等[6]的染色体分组标准进行核型分析。
2 结果与分析
2.1 五强溪水库斑点叉尾鮰体细胞染色体数目
由表1可知，计数6尾斑点叉尾鮰的中期分裂相共50个，染色体数目分别在55以下、55、60和60以上的各有1个细胞，染色体数目为56、59的各有2个细胞，染色体数目为58的有39个细胞，染色体数目为57的有3个细胞。染色体数目为58的占计数细胞总数的78%，众数百分率高于75%的常规标准，因此确定五强溪水库斑点叉尾鮰的标准染色体数目2N = 58（图1）。在斑点叉尾鮰的雌、雄个体间未发现与性别有关的异形性染色体，也未发现带有特殊标志性特征（如随体、次缢痕）的染色体。
2.2 五强溪水库斑点叉尾鮰的染色体组型
根据染色体相对长度和臂比值的测量结果（表2），将斑点叉尾鮰的全部染色体配成29对，参照Levan命名法[6]，五强溪水库斑点叉尾鮰的核型由4对中部着丝点染色体、5对亚中部着丝点染色体、13对亚端部着丝点染色体和7对端部着丝点染色体组成（图2），核型公式为2N = 8M+10 SM+26 ST+14 T，染色体臂数（NF）= 76。
3 讨论与结论
斑点叉尾鮰自1984年从美国引进至今已有30多年的历史，由于它具有较高的养殖经济效益，目前在国内许多地区的水库、池塘中都有养殖。该试验以沅水五强溪水库的斑点叉尾鮰为研究对象，对其体细胞染色体组型进行了研究。
结果表明，五强溪水库斑点叉尾鮰的二倍体染色体数目为58，核型公式为2N=8M+10SM+26ST+14T，染色体臂数（NF）= 76，与张芹等[7]报道的河南省水产科学研究院引进的斑点叉尾鮰进行比较，发现二者的染色体数目均为58，但核型存在一定差异，河南斑点叉尾鮰种群的核型公式为2N=6M+10SM+22ST+20T，NF=74。该研究中沅水五强溪水库斑点叉尾鮰的M和ST染色体比河南种群分别多1对和2对，SM染色体不变，T染色体减少3对，染色体总臂数增加2条。造成这种差异的原因，可能与不同研究者使用的试验方法不同，或者与测量和配组产生的误差有关；但也可能是由于不同种群所表现出的染色体多态性所造成的。张芹等[7]报道国内引进的斑点叉尾鮰大多来自于美国的德克萨斯州、阿拉巴马州、密西西比州等地理种群，其染色体数目为56或58，染色体臂数为72、90或92不等，染色体组型也不尽相同。刘海韵等[8]和崔蕾等[9]采用分子生物学方法也证实了斑点叉尾鮰不同地理种群的遗传差异和多样性。斑点叉尾鮰种群丰富的遗传多样性，为这一养殖品种的资源保护和遗传改良提供了物质基础，利用这些遗传多样性丰富的群体进行杂交选育，生产上可以避免种质的退化，保证我国斑点叉尾鮰养殖业的健康可持续发展。
斑点叉尾鮰作为一种引进的外来养殖品种，在带来较高经济效益的同时，亦可能给当地生态安全造成影响。由于斑点叉尾鮰食性杂、抗逆性强、适应范围广，像五强溪水库这样的水面资源和天然饵料丰富的水域生态系统，非常适合斑点叉尾鮰的生长，若不加以人为控制，其种群数量将会大幅增加，除了与本地鱼种争夺生存空间，导致本地土著鱼种和数量的急剧减少外，还可能与本地近缘种进行杂交，杂交后代再与本地其他近缘种杂交而造成遗传侵蚀[2，10]。该试验中斑点叉尾鮰的染色体数目与同属于鲇形目的本地鲇[11]、大口鲇[12]的染色体数目相同（均为58），虽然核型上存在差异，但在天然水体中如果长期共存，不排除它们存在科间杂交并产生可繁育子代的可能性。因此，对于网箱和池塘养殖或者已经逃逸到天然水体的斑点叉尾鮰，都必须采取相应的强有力措施，严防其向天然水体大量扩散，避免对本地鱼种的遗传污染。
参考文献
[1] 刘良国，杨春英，杨品红，等.湖南境内沅水鱼类资源现状与多样性分析[J].海洋与湖沼，2013，44（1）：148-158.
[2] 卜跃先，谢初昀，刘鑫宇，等.引进外来物种的环境风险评价初探：以美国斑点叉尾鮰为例[J].水利渔业，2008，28（1）：82-84.
[3] 麻韶霖.华中斑点叉尾鮰产业发展走势分析[J].当代水产，2012（1）：42-44.
[4] 周国平.中国斑点叉尾鮰产业的现状及发展建议[J].中国水产，2005（6）：26-28.
[5] 刘良国，赵俊，崔淼，等.尖鳍鲤的染色体组型分析[J].华南师范大学学报（自然科学版），2004（1）：108-111.
[6] LEVAN A，TREDGA K，SANDBERG A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes [J].Heredita，1964，52（2）：201-220.
[7] 张芹，宋威，惠筠，等.斑点叉尾鮰染色体组型的研究[J].河南水产，2009（1）：35-36.
[8] 刘海韵，周勤洁，雷靖靖，等.不同地区斑点叉尾鮰种内遗传多样性分析[J].氨基酸和生物资源，2008，30（4）：1-6.
[9] 崔蕾，谢从新，李艳和，等.斑点叉尾鮰4个群体遗传多样性的微卫星分析[J].华中农业大学学报，2012，31（6）：744-751.
[10] 楼允东，李小勤.中国鱼类远缘杂交研究及其在水产养殖上的应用[J].中国水产科学，2006，13（1）：151-158.
[11] 韩庆，秦杰，席在星.洞庭湖土鲶染色体核型分析[J].水产科学，2009，28（8）：462-464.
[12] 邹桂伟，潘光碧，梁拥军，等.大口鲇染色体组型和DNA含量的研究[J].中国水产科学，1997，4（5）：96-99.