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[摘要] 目的 研究虎杖苷（polydatin，PD）抑制高糖引起心肌细胞局部钙信号紊乱的机制，探讨其对糖尿病心肌病的保护作用。 方法 分离1～3 d SD大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为四组：对照组、高糖组、虎杖苷组和高糖 虎杖苷组。培养48 h后采用激光共聚焦显微成像技术检测局部钙释放单位钙火花发放频率及其形态；利用Western blot方法检测受磷蛋白PLB和肌浆网SERCA 2a蛋白的表达水平。 结果 高糖组心肌细胞钙自发钙火花发放水平显著增加（P<0.01），且略微增加钙火花时程。在虎杖苷组中，高糖引起的高频钙火花发放显著抑制（P<0.01）。与对照组相比，高糖增加心肌细胞内静息期细胞内钙离子水平，给予PD治疗则抑制高糖引起钙超载。PD抑制高糖引起的心肌细胞ROS水平增加。高糖下调PLB和SERCA 2a蛋白的表达。 结论 PD通过降低细胞自发钙火花的频率，抑制肌浆网钙漏流、增加钙稳定性，调节PLB/SERCA 2a蛋白比例，从而有效纠正高糖所致心肌细胞局部钙调控紊乱。因此，PD可能在糖尿病心肌病患者中发挥着重要的心肌保护作用。
[关键词] 虎杖苷；高糖；心肌细胞；钙漏流；钙火花
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0020-04
虎杖苷是从传统中药虎杖（Polygonum Cuspidatun Sieb.et Zucc）中提取的单体，因其化学结构为白黎芦醇与葡萄糖的结合产物，故又称白黎芦醇苷（piceid），属羟基二苯乙烯类化合物。研究发现虎杖苷具有多种生物活性，尤其对心脑血管系统具有独特的改善效果。
随着糖尿病发病的日益流行，独立于冠状动脉粥样硬化之外的糖尿病心肌病，其发病比例显著增高。其中无症状性左室舒张功能不全是2型糖尿病心肌病的早期病变，随着疾病进展，左室收缩期功能受损，最终导致心衰发生。研究表明糖尿病患者70%以上死于心血管疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率2～3倍。故深入研究糖尿病心肌病的发病机制，为早期保护心脏功能，提高糖尿病患者生活质量，尤为重要[1，2]。糖尿病患者多伴随有高血糖，长期的高血糖带来的危害是持续、多面性的。然而高血糖对心肌细胞局部钙信号的调控仍不清楚。因此，本研究探明高糖对心肌细胞的局部钙信号的调控，并探讨虎杖苷纠正高糖引起心肌细胞钙紊乱的作用及其机制。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
1～3 d SD大鼠乳鼠20只，从广东省实验动物中心购买，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。虎杖苷由深圳海王生物有限公司提供；抗SERCA蛋白抗体（Ab1）、PLB抗体购于美国Alomone公司；蛋白质测定试剂盒购于Bio-Rad公司；ECL检测试剂盒购于Invitrogen公司；胶原酶Ⅱ购于Worthington公司；5-溴脱氧尿嘧啶和胰蛋白酶（Sigma，美国）；DMEM培养基（Gibco，美国）；新生牛血清（NBCS）为Gibco；Fluo-4 AM和H2DCFDA购于Invitrogen公司，其余无特别说明为国产分析纯。主要的实验仪器为：Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜（Zeiss，德国）。
1.2 方法
1.2.1 乳鼠心肌细胞的原代培养 采用胰蛋白酶消化的方法分离乳鼠心肌细胞[3]。取 1～3 d 龄SD大鼠，在无菌条件下开胸，采用眼科镊快速取下心脏并置于冰冷的PBS缓冲液中清洗3次。取心尖部组织剪为1 mm3碎块，再用PBS液清洗，以清除血细胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，弃上清，剩余组织块中加入混合消化酶（0.08%胰蛋白酶加 0.04%～0.06%Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化5～10 min多次，将各次消化制成的细胞悬液合并后，通过150目孔径的不锈钢网滤过。将细胞悬液接种于60 mm培养板中，采取差速法贴壁心肌细胞：37℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，分离纯化心肌细胞。将纯化的细胞按0.8×105/m2～1.0×105/m2的密度接种于35 mm培养皿中。
1.2.2 分组 细胞被随机分成四组：对照组（Control）、高糖组（High glucose，HG）、虎杖苷组（polydatin，PD）和高糖 虎杖苷组（HG PD）。对照组给予甘露醇25 mM，高糖组给予25 mM葡萄糖，虎杖苷组给予30 μM PD 25 mM甘露醇，高糖 虎杖苷组给予30 μMPD 25 mM D-Glu，培养48 h后进行钙信号检测和Western blot检测。
1.2.3 荧光染料的加载 在室温下避光下把钙荧光指示剂Fluo-4 AM（5 μmol/L）与细胞共同孵育8 min。染色后将细胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦显微镜系统的载物台上，并灌以台氏液。
1.2.4 钙火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜线扫描方式，在400倍镜下，选取合适的细胞、保持相同采样速率为3.84 ms/线，连续采集1000条线。在采集过程中放大倍数和采样速度应尽量保持一致，以方便后期的数据统计分析。激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。
1.2.5 ROS的检测 细胞内ROS水平采用2’，7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate（H2DCFDA）荧光探针进行检测。在室温下将细胞和荧光探针（10 μM）共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜面扫描的方式，激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。为了保持结果的可比性，荧光探针的加载条件和荧光的采集条件需要完全一致。
1.3 统计学处理 綜上所述，糖尿病心功能障碍的一个重要机制是SR钙漏流增加及钙调节蛋白表达异常。虎杖苷可以减少高糖引起的肌浆网钙漏流，缓解心肌细胞钙超载，增加心肌细胞钙离子的稳定性；同时抑制氧化应激损伤、调节心肌细胞钙调节蛋白表达，增加心功能，从而起到心肌保护作用。对于糖尿病心肌病患者，虎杖苷减少心肌浆网钙漏流有可能是早期治疗糖尿病心肌病的一个新的靶点。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的进展，改善心功能，为糖尿病心功能障碍的临床治疗提供实验依据和新的思路。
[参考文献]
[1] Beisswenger PJ，Howell SK，Touchette AD，et al. Metformin reduces systemic methylglyoxal levels in type 2 diabetes[J].Diabetes，1999，48（1）：198-202.
[2] Zhou G，Myers R，Li Y，Chen Y，et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action[J]. J Clin Invest，2001，108（8）：1167-1174.
[3] Liu W，Deng J，Xu J，et al. High-mobility group box 1（HMGB1） downregulates cardiac transient outward potassium current（Ito） through downregulation of kv4.2 and kv4.3 channel transcripts and proteins[J]. J Mol Cell Cardiol，2010，49（3）：438-448.
[4] Cheng H，Song LS，Shirokova N，et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images：Theory and studies with an automatic detection method[J]. Biophysical Journal，1999，76 （2）：606-617.
[5] Ramasamy R，Vannucci SJ，Yan SS，et al. Advanced glycation end products and rage：A common thread in aging，diabetes，neurodegeneration，and inflammation[J]. Glycobiology，2005，15（7）：16R-28R.
[6] Parker HE，Wallis K，le Roux CW，et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion[J]. British Journal of Pharmacology，2012，165（2）：414-423.
[7] Arozal W，Watanabe K，Veeraveedu PT，et al. Effects of angiotensin receptor blocker on oxidative stress and cardio-renal function in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Biological
[关键词] 虎杖苷；高糖；心肌细胞；钙漏流；钙火花
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0020-04
虎杖苷是从传统中药虎杖（Polygonum Cuspidatun Sieb.et Zucc）中提取的单体，因其化学结构为白黎芦醇与葡萄糖的结合产物，故又称白黎芦醇苷（piceid），属羟基二苯乙烯类化合物。研究发现虎杖苷具有多种生物活性，尤其对心脑血管系统具有独特的改善效果。
随着糖尿病发病的日益流行，独立于冠状动脉粥样硬化之外的糖尿病心肌病，其发病比例显著增高。其中无症状性左室舒张功能不全是2型糖尿病心肌病的早期病变，随着疾病进展，左室收缩期功能受损，最终导致心衰发生。研究表明糖尿病患者70%以上死于心血管疾病，是非糖尿病人群心血管系统疾病病死率2～3倍。故深入研究糖尿病心肌病的发病机制，为早期保护心脏功能，提高糖尿病患者生活质量，尤为重要[1，2]。糖尿病患者多伴随有高血糖，长期的高血糖带来的危害是持续、多面性的。然而高血糖对心肌细胞局部钙信号的调控仍不清楚。因此，本研究探明高糖对心肌细胞的局部钙信号的调控，并探讨虎杖苷纠正高糖引起心肌细胞钙紊乱的作用及其机制。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
1～3 d SD大鼠乳鼠20只，从广东省实验动物中心购买，动物许可证号：SCXK（粤）2013-0002。虎杖苷由深圳海王生物有限公司提供；抗SERCA蛋白抗体（Ab1）、PLB抗体购于美国Alomone公司；蛋白质测定试剂盒购于Bio-Rad公司；ECL检测试剂盒购于Invitrogen公司；胶原酶Ⅱ购于Worthington公司；5-溴脱氧尿嘧啶和胰蛋白酶（Sigma，美国）；DMEM培养基（Gibco，美国）；新生牛血清（NBCS）为Gibco；Fluo-4 AM和H2DCFDA购于Invitrogen公司，其余无特别说明为国产分析纯。主要的实验仪器为：Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜（Zeiss，德国）。
1.2 方法
1.2.1 乳鼠心肌细胞的原代培养 采用胰蛋白酶消化的方法分离乳鼠心肌细胞[3]。取 1～3 d 龄SD大鼠，在无菌条件下开胸，采用眼科镊快速取下心脏并置于冰冷的PBS缓冲液中清洗3次。取心尖部组织剪为1 mm3碎块，再用PBS液清洗，以清除血细胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，弃上清，剩余组织块中加入混合消化酶（0.08%胰蛋白酶加 0.04%～0.06%Ⅱ型胶原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化5～10 min多次，将各次消化制成的细胞悬液合并后，通过150目孔径的不锈钢网滤过。将细胞悬液接种于60 mm培养板中，采取差速法贴壁心肌细胞：37℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，分离纯化心肌细胞。将纯化的细胞按0.8×105/m2～1.0×105/m2的密度接种于35 mm培养皿中。
1.2.2 分组 细胞被随机分成四组：对照组（Control）、高糖组（High glucose，HG）、虎杖苷组（polydatin，PD）和高糖 虎杖苷组（HG PD）。对照组给予甘露醇25 mM，高糖组给予25 mM葡萄糖，虎杖苷组给予30 μM PD 25 mM甘露醇，高糖 虎杖苷组给予30 μMPD 25 mM D-Glu，培养48 h后进行钙信号检测和Western blot检测。
1.2.3 荧光染料的加载 在室温下避光下把钙荧光指示剂Fluo-4 AM（5 μmol/L）与细胞共同孵育8 min。染色后将细胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦显微镜系统的载物台上，并灌以台氏液。
1.2.4 钙火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜线扫描方式，在400倍镜下，选取合适的细胞、保持相同采样速率为3.84 ms/线，连续采集1000条线。在采集过程中放大倍数和采样速度应尽量保持一致，以方便后期的数据统计分析。激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。
1.2.5 ROS的检测 细胞内ROS水平采用2’，7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate（H2DCFDA）荧光探针进行检测。在室温下将细胞和荧光探针（10 μM）共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦显微镜面扫描的方式，激发光波长为488 nm，收集波长为505 nm以上的发射光。为了保持结果的可比性，荧光探针的加载条件和荧光的采集条件需要完全一致。
1.3 统计学处理 綜上所述，糖尿病心功能障碍的一个重要机制是SR钙漏流增加及钙调节蛋白表达异常。虎杖苷可以减少高糖引起的肌浆网钙漏流，缓解心肌细胞钙超载，增加心肌细胞钙离子的稳定性；同时抑制氧化应激损伤、调节心肌细胞钙调节蛋白表达，增加心功能，从而起到心肌保护作用。对于糖尿病心肌病患者，虎杖苷减少心肌浆网钙漏流有可能是早期治疗糖尿病心肌病的一个新的靶点。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的进展，改善心功能，为糖尿病心功能障碍的临床治疗提供实验依据和新的思路。
[参考文献]
[1] Beisswenger PJ，Howell SK，Touchette AD，et al. Metformin reduces systemic methylglyoxal levels in type 2 diabetes[J].Diabetes，1999，48（1）：198-202.
[2] Zhou G，Myers R，Li Y，Chen Y，et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action[J]. J Clin Invest，2001，108（8）：1167-1174.
[3] Liu W，Deng J，Xu J，et al. High-mobility group box 1（HMGB1） downregulates cardiac transient outward potassium current（Ito） through downregulation of kv4.2 and kv4.3 channel transcripts and proteins[J]. J Mol Cell Cardiol，2010，49（3）：438-448.
[4] Cheng H，Song LS，Shirokova N，et al. Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images：Theory and studies with an automatic detection method[J]. Biophysical Journal，1999，76 （2）：606-617.
[5] Ramasamy R，Vannucci SJ，Yan SS，et al. Advanced glycation end products and rage：A common thread in aging，diabetes，neurodegeneration，and inflammation[J]. Glycobiology，2005，15（7）：16R-28R.
[6] Parker HE，Wallis K，le Roux CW，et al. Molecular mechanisms underlying bile acid-stimulated glucagon-like peptide-1 secretion[J]. British Journal of Pharmacology，2012，165（2）：414-423.
[7] Arozal W，Watanabe K，Veeraveedu PT，et al. Effects of angiotensin receptor blocker on oxidative stress and cardio-renal function in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Biological