【摘 要】
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目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)体外高效表达体系.方法将一B区缺失(760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧcDNA BD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX,构建了重组表达载体LN
【机 构】
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上海瑞金医院上海,中国科学研究所上海
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目的建立逆转录病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)体外高效表达体系.方法将一B区缺失(760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧcDNA BD)克隆至逆转录病毒载体pLNCX,构建了重组表达载体LNC-ⅧBD.经PA317细胞包装后,感染多种靶细胞.分别采用一期法、ELISA法和RT-PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ∶C)和抗原含量(FⅧ∶Ag)以及细胞中FⅧcDNA BD的转录.结果重组逆转录病毒载体LNC-ⅧBD在四种靶细胞中有不同程度的表达.其中以NIH3T3细胞的表达最高,FⅧ∶C为1.6?U/106细胞*24?hrs-1,FⅧ∶Ag为500?ng/106细胞*24?hrs-1.CHO细胞表达的FⅧ∶C活性为0.12?U/106细胞*24?hrs-1,FⅧ∶Ag为62.4?ng/106细胞*24?hrs-1.FⅧ在Cos-7和一正常成人肝细胞系L-02中表达较低.RT-PCR可检测到靶细胞中人FⅧcDNA BD的转录的mRNA.结论逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达,为血友病A的基因治疗奠定了基础.
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