【摘 要】
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葡糖醛酸C5-差向异构酶(C5-epi)是肝素/硫酸乙酰肝素生物合成的关键酶之一,本文通过无缝克隆技术将人源C5-epi基因克隆至pFastBacl质粒构建重组载体,转化至含杆状病毒穿梭载
【机 构】
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山东大学药学院,山东济南250012
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葡糖醛酸C5-差向异构酶(C5-epi)是肝素/硫酸乙酰肝素生物合成的关键酶之一,本文通过无缝克隆技术将人源C5-epi基因克隆至pFastBacl质粒构建重组载体,转化至含杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DHlOaBac感受态细胞并发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-C5-epi;在脂质体介导下将穿梭质粒转染昆虫细胞Sf9产生重组病毒,扩增病毒感染昆虫细胞Sf9进行蛋白表达;采用Western blot-ting鉴定Sf9培养上清中C5-epi的表达情况,以合成的肝素五糖为底物测定C5-epi酶的活力;采用Reed-Muench两氏计算法和TCID50计算病毒滴度并优化表达条件;采用Ni-NTA亲和层析柱纯化上清液.结果表明,Western blotting表明重组C5-epi以分泌蛋白的形式在昆虫细胞Sf9中正确表达,且具有C5异构化酶活性;采用感染复数(MOI)为1、感染时间(TOI)为72 h,重组活性酶在昆虫细胞Sf9中的表达达到峰值;纯化后的C5-epi的酶比活达118.57 U/μg,是大肠杆菌表达的酶活27.32倍.因此,在Sf9昆虫细胞中表达得到活性高的重组人源C5-epi酶,适合用于肝素/硫酸乙酰肝素寡糖的高效合成和规模化制备.
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