【摘 要】
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目的:提供ΦC31整合酶研究所需的大量纯化蛋白质及特异性抗体.方法:将编码ΦC31整合酶的ORF插入到pET22b+载体构建表达质粒并转化E.coli B121(DE3),用IPTG诱导表达His-C31整
【基金项目】
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国家高技术研究发展计划(863计划);国家重点基础研究发展计划(九七三计划)资助项目
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目的:提供ΦC31整合酶研究所需的大量纯化蛋白质及特异性抗体.方法:将编码ΦC31整合酶的ORF插入到pET22b+载体构建表达质粒并转化E.coli B121(DE3),用IPTG诱导表达His-C31整合酶融合蛋白,His-Bind Quick Cartridge纯化表达产物.重组蛋白作为抗原常规免疫家兔制备相应的多克隆抗体,Western blotting确定抗体的特异性,体外线性底物分子内重组检测系统检测抗体的活性.最后用该抗体检测了ΦC31整合酶在真核细胞HEK293中的定位和分布.结果:16℃条件下0.2 mmol/L IPTG诱导培养30 h,携带pET22b-ΦC31质粒的E.coli BL21(DE3)在YTG培养基中,可表达出大量的融合蛋白,该蛋白经体外线性底物分子内重组检测系统检验具有较高的活性.使用该融合蛋白免疫新西兰大白兔后.分离兔血清可得到ΦC31整合酶多克隆抗体,Western blotting和荧光免疫细胞组织化学方法证实,该抗体可特异性地识别细菌及细胞表达的ΦC31整合酶蛋白抗原.结论:本实验建立了表达ΦC31整合酶的方法,并成功制备了ΦC31整合酶特异性抗体.
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