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摘要：目的 采用气相色谱法测定参苓白术散中樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的含量，并建立其质量标准。方法 采用100%甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱；程序升温：起始温度60 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，保持5 min，续以20 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。结果 樟脑平均回收率为99.87%，RSD=1.3%，进样量在0.003 77～0.150 8 ?g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）；龙脑平均回收率为100.71%，RSD=2.1%，进样量在0.002 411～0.096 4 ?g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）；乙酸龙脑酯平均回收率为101.95%，RSD=1.3%，进样量在0.003 02～0.121 1 ?g范围内呈良好的线性关系（r=0.999 9）。结论 本方法操作简便，结果可靠、准确，能有效控制参苓白术散中砂仁的质量。
关键词：参苓白术散；砂仁；樟脑；龙脑；乙酸龙脑酯；气相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0056-03
参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，2009年收载入《国家基本药物目录》，现收载于2010年版《中华人民共和国药典》（一部）。处方由人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、莲子、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草共10味药组成，为全原粉入药，有补脾胃、益肺气的功效，主要用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力[1]。其中砂仁有醒牌和胃、行气化滞的功效，其挥发性成分为有效成分，在制剂中发挥其药理作用。砂仁的主要成分为龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯，可选择以上3种作为指标性成分，测定其含量，达到控制砂仁药材质量的目的[1]。目前参苓白术散质量标准未收载含量测定项，有文献报道对处方中人参、甘草的含量进行了研究[2-3]，但未对砂仁的有效成分进行测定。本试验建立参苓白术散中龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯的含量测定方法，并对收集到的13家企业生产的29批制剂进行测定，为控
制其质量提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 6890气相色谱仪（美国安捷伦公司），氢火焰离子检测器（FID，美国安捷伦公司）；Mettler Toledo AG135十万分之一电子分析天平（瑞士METTER公司）。
樟脑对照品（供含量测定用，批号110747-201008，按99.0%计）、龙脑对照品（供含量测定用，批号110881-200706，按99.2%计）、乙酸龙脑酯对照品（供含量测定用，批号110759-200303），均由中国药品生物制品检定所提供。试剂均为分析纯，水为去离子水。参苓白术散为市售的13家企业生产样品的抽样29批（生产企业以字母代替，批号以数字代替）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
100%甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，程序升温（起始温度60 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，保持5 min，续以20 ℃/min升到230 ℃，保持5 min），柱流量1.1 mL/min，分别设定进样
口、FID检测器温度为300 ℃[4-6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取樟脑对照品9.52 mg，置10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为樟脑贮备液。精密称取龙脑对照品12.15 mg，置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为龙脑贮备液。精密称取乙酸龙脑酯对照品30.27 mg，置100 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为乙酸龙脑酯贮备液。精密吸取樟脑贮备液2 mL、龙脑贮备液1 mL、乙酸龙脑酯贮备液各5 mL，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，即为混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品6 g，精密称定，至圆底烧瓶中，连接挥发油提取器，加水200～300 mL，并从发油提取器上方加入乙酸乙酯1 mL，加热回流1 h。吸取挥发油提取器中乙酸乙酯液置5 mL容量瓶中，再用乙酸乙酯3 mL分次洗涤挥发油提取器，并入5 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。色谱图见图1。
2.4 空白试验
按处方中药味比例，配制不含砂仁的诸药，按其制法制成空白制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，进样量1 ?L。结果阴性对照溶液在与樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯对照品相同保留时间处，未显示色谱峰，认为无干扰。见图1。
2.5 线性关系考察
精密吸取含0.037 70 mg/mL樟脑对照品、0.0241 mg/mL龙脑对照品、0.030 27 mg/mL乙酸龙脑酯对照品的混合溶液0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、4 ?L，注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：樟脑Y=0.000 06X-0.000 36，r=0.999 9（n=6）；龙脑Y=0.000 05X+0.000 21，r=0.999 9 （n=6）；乙酸龙脑酯Y=0.000 07X-0.000 22，r=0.999 9 （n=6）。结果表明，樟脑在0.003 77～0.150 8 ?g范围内、龙脑在0.002 411～0.096 4 ?g范围内、乙酸龙脑酯在0.003 02～0.121 1 ?g范围内线性关系良好。
2.6 重复性试验
分别精密称取6份样品（H企业生产，批号为4），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，注入气相色谱仪，樟脑峰面积的RSD=1.8%，龙脑峰面积的RSD=1.9%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=1.9%，表明本方法测定供试品中樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的含量重复性较好。 2.7 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液1 ?L，注入气相色谱仪，重复进样6次，结果樟脑峰面积的RSD=0.42%，龙脑峰面积的RSD=0.51%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=0.49%。表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、4、20 h，依法测定，结果表明，供试品溶液在20 h内基本稳定。樟脑峰面积的RSD=1.2%，龙脑峰面积的RSD=1.7%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=3.1%。表明本法稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品（樟脑含量为0.073 79 mg/g，龙脑含量为0.019 78 mg/g，乙酸龙脑酯含量为0.027 95 mg/g）3 g，精密加入混合对照品溶液（含樟脑0.240 4 mg/mL，龙脑0.058 61 mg/mL，乙酸龙脑酯0.092 8 mg/mL） 5 mL，平行制备6份，依法测定，结果表明均具有良好的准确度。见表1～表3。
2.10 样品含量测定
按照上述测定方法，对市售的13家企业29批次参苓白术散进行检验，结果见表4。
3 讨论
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）“砂仁”项下仅规定了乙酸龙脑酯的含量，经查阅文献报道，不同来源的砂仁中均含有樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯，但含量高低不同，故拟定以3种含量总和计。不同来源的砂仁挥发油含量不同，药典规定的挥发油含量最低不少于1%，文献报道的3种成分总和最低可占总挥发性成分的50%[5]，故以此来推算砂仁中3种成分总量的理论值。散剂中砂仁为原粉入药，无提取工艺，但由于挥发性成分不稳定，考虑到标准检验中无此含量测定项，生产企业在工艺上亦未对此成分进行控制，故3种成分总量转移率按不低于80%计算，拟定制剂中含樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯总量应不得少于0.25 mg/g。
本试验对提取时间进行了考察，取同一批号的样品适量，连接挥发油提取器，加入乙酸乙酯1 mL，分别回流提取1、2、3、4 h，依法测定，结果回流提取1 h效率最高，3种成分可提取完全。
通过对29批样品中砂仁的含量测定，发现各生产企业存在较严重的问题：由于现行标准未规定砂仁的含量测定项，导致部分企业投料用药材的质量不符合规定，或灭菌工艺不合理导致挥发性成分大量损失，或擅自改变工艺等现象的发生。因此，有必要制定砂仁的含量测定项，从而对砂仁的质量及药品的有效性进行评价。本研究所建立的砂仁含量测定方法可操作性、可控性较强，建议在新的质量标准中增加砂仁的含量测定项。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：300-301.
[2] 丁涛.参苓白术散中人参皂苷的含量测定[J].中国中医基础医学杂志，2012，18（10）：1134-1135.
[3] 王二兵，曲婷丽，赵正保，HPLC法测定参苓白术颗粒中甘草酸的含量[J].山西医科大学学报，2008，39（1）：38-40.
[4] 尹雪.广藿香、阳春砂仁、藿香正气制剂特征指纹图谱数字化标准的构建与应用[D].广州：广州中医药大学，2009.
[5] 陈程，阳春砂仁化学成分及指纹图谱初步研究[D].广州：暨南大学， 2012.
[6] 丁平，曾元儿，何智健，等.不同产地阳春砂挥发油气相色谱指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2004，39（6）：418-420.
（收稿日期：2013-05-15，编辑：陈静）
关键词：参苓白术散；砂仁；樟脑；龙脑；乙酸龙脑酯；气相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.021
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0056-03
参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，2009年收载入《国家基本药物目录》，现收载于2010年版《中华人民共和国药典》（一部）。处方由人参、茯苓、白术、山药、白扁豆、莲子、薏苡仁、砂仁、桔梗、甘草共10味药组成，为全原粉入药，有补脾胃、益肺气的功效，主要用于脾胃虚弱，食少便溏，气短咳嗽，肢倦乏力[1]。其中砂仁有醒牌和胃、行气化滞的功效，其挥发性成分为有效成分，在制剂中发挥其药理作用。砂仁的主要成分为龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯，可选择以上3种作为指标性成分，测定其含量，达到控制砂仁药材质量的目的[1]。目前参苓白术散质量标准未收载含量测定项，有文献报道对处方中人参、甘草的含量进行了研究[2-3]，但未对砂仁的有效成分进行测定。本试验建立参苓白术散中龙脑、樟脑、乙酸龙脑酯的含量测定方法，并对收集到的13家企业生产的29批制剂进行测定，为控
制其质量提供依据。
1 仪器与试药
Agilent 6890气相色谱仪（美国安捷伦公司），氢火焰离子检测器（FID，美国安捷伦公司）；Mettler Toledo AG135十万分之一电子分析天平（瑞士METTER公司）。
樟脑对照品（供含量测定用，批号110747-201008，按99.0%计）、龙脑对照品（供含量测定用，批号110881-200706，按99.2%计）、乙酸龙脑酯对照品（供含量测定用，批号110759-200303），均由中国药品生物制品检定所提供。试剂均为分析纯，水为去离子水。参苓白术散为市售的13家企业生产样品的抽样29批（生产企业以字母代替，批号以数字代替）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
100%甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管柱，程序升温（起始温度60 ℃，以5 ℃/min升到130 ℃，保持5 min，续以20 ℃/min升到230 ℃，保持5 min），柱流量1.1 mL/min，分别设定进样
口、FID检测器温度为300 ℃[4-6]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取樟脑对照品9.52 mg，置10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为樟脑贮备液。精密称取龙脑对照品12.15 mg，置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为龙脑贮备液。精密称取乙酸龙脑酯对照品30.27 mg，置100 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解，并稀释至刻度，作为乙酸龙脑酯贮备液。精密吸取樟脑贮备液2 mL、龙脑贮备液1 mL、乙酸龙脑酯贮备液各5 mL，置50 mL量瓶中，加乙酸乙酯使溶解并稀释至刻度，摇匀，即为混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品6 g，精密称定，至圆底烧瓶中，连接挥发油提取器，加水200～300 mL，并从发油提取器上方加入乙酸乙酯1 mL，加热回流1 h。吸取挥发油提取器中乙酸乙酯液置5 mL容量瓶中，再用乙酸乙酯3 mL分次洗涤挥发油提取器，并入5 mL量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度。色谱图见图1。
2.4 空白试验
按处方中药味比例，配制不含砂仁的诸药，按其制法制成空白制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，按上述色谱条件测定，进样量1 ?L。结果阴性对照溶液在与樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯对照品相同保留时间处，未显示色谱峰，认为无干扰。见图1。
2.5 线性关系考察
精密吸取含0.037 70 mg/mL樟脑对照品、0.0241 mg/mL龙脑对照品、0.030 27 mg/mL乙酸龙脑酯对照品的混合溶液0.1、0.2、0.3、0.5、1、3、4 ?L，注入色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：樟脑Y=0.000 06X-0.000 36，r=0.999 9（n=6）；龙脑Y=0.000 05X+0.000 21，r=0.999 9 （n=6）；乙酸龙脑酯Y=0.000 07X-0.000 22，r=0.999 9 （n=6）。结果表明，樟脑在0.003 77～0.150 8 ?g范围内、龙脑在0.002 411～0.096 4 ?g范围内、乙酸龙脑酯在0.003 02～0.121 1 ?g范围内线性关系良好。
2.6 重复性试验
分别精密称取6份样品（H企业生产，批号为4），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，注入气相色谱仪，樟脑峰面积的RSD=1.8%，龙脑峰面积的RSD=1.9%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=1.9%，表明本方法测定供试品中樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯的含量重复性较好。 2.7 精密度试验
精密吸取同一供试品溶液1 ?L，注入气相色谱仪，重复进样6次，结果樟脑峰面积的RSD=0.42%，龙脑峰面积的RSD=0.51%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=0.49%。表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别于配制后0、4、20 h，依法测定，结果表明，供试品溶液在20 h内基本稳定。樟脑峰面积的RSD=1.2%，龙脑峰面积的RSD=1.7%，乙酸龙脑酯峰面积的RSD=3.1%。表明本法稳定性良好。
2.9 加样回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品（樟脑含量为0.073 79 mg/g，龙脑含量为0.019 78 mg/g，乙酸龙脑酯含量为0.027 95 mg/g）3 g，精密加入混合对照品溶液（含樟脑0.240 4 mg/mL，龙脑0.058 61 mg/mL，乙酸龙脑酯0.092 8 mg/mL） 5 mL，平行制备6份，依法测定，结果表明均具有良好的准确度。见表1～表3。
2.10 样品含量测定
按照上述测定方法，对市售的13家企业29批次参苓白术散进行检验，结果见表4。
3 讨论
2010年版《中华人民共和国药典》（一部）“砂仁”项下仅规定了乙酸龙脑酯的含量，经查阅文献报道，不同来源的砂仁中均含有樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯，但含量高低不同，故拟定以3种含量总和计。不同来源的砂仁挥发油含量不同，药典规定的挥发油含量最低不少于1%，文献报道的3种成分总和最低可占总挥发性成分的50%[5]，故以此来推算砂仁中3种成分总量的理论值。散剂中砂仁为原粉入药，无提取工艺，但由于挥发性成分不稳定，考虑到标准检验中无此含量测定项，生产企业在工艺上亦未对此成分进行控制，故3种成分总量转移率按不低于80%计算，拟定制剂中含樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯总量应不得少于0.25 mg/g。
本试验对提取时间进行了考察，取同一批号的样品适量，连接挥发油提取器，加入乙酸乙酯1 mL，分别回流提取1、2、3、4 h，依法测定，结果回流提取1 h效率最高，3种成分可提取完全。
通过对29批样品中砂仁的含量测定，发现各生产企业存在较严重的问题：由于现行标准未规定砂仁的含量测定项，导致部分企业投料用药材的质量不符合规定，或灭菌工艺不合理导致挥发性成分大量损失，或擅自改变工艺等现象的发生。因此，有必要制定砂仁的含量测定项，从而对砂仁的质量及药品的有效性进行评价。本研究所建立的砂仁含量测定方法可操作性、可控性较强，建议在新的质量标准中增加砂仁的含量测定项。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：300-301.
[2] 丁涛.参苓白术散中人参皂苷的含量测定[J].中国中医基础医学杂志，2012，18（10）：1134-1135.
[3] 王二兵，曲婷丽，赵正保，HPLC法测定参苓白术颗粒中甘草酸的含量[J].山西医科大学学报，2008，39（1）：38-40.
[4] 尹雪.广藿香、阳春砂仁、藿香正气制剂特征指纹图谱数字化标准的构建与应用[D].广州：广州中医药大学，2009.
[5] 陈程，阳春砂仁化学成分及指纹图谱初步研究[D].广州：暨南大学， 2012.
[6] 丁平，曾元儿，何智健，等.不同产地阳春砂挥发油气相色谱指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2004，39（6）：418-420.
（收稿日期：2013-05-15，编辑：陈静）