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目前实验室作为HIV初筛检测主要是HIV病毒抗体检测。由于它的灵敏度和特异性高,而且方法相对简单、成熟,更重要的是HIV抗体在病毒感染后,除早期短暂的窗口期外的整个生命期间长期稳定地存在并可被检测到。
在HIV初筛实验室,ELISA是常用的抗体筛查方法。ELISA是一种免疫测定,通常采用双抗原夹心法。其原理为预包被高纯度重组HIV(1+2型)抗原,可与样品中抗HIV抗体反应,同时加入HRP标记HIV(1+2型)抗原,然后用TMB底物作用显色。通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定样品中HIV抗体的存在与否。
ELISA试验的步骤对检测结果有很大的影响,每个步骤均应认真负责才能充分发挥ELISA灵敏和特异的优点。如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。现将操作中各个环节中要注意的问题及解决办法总结如下,以期提高试验质量。
标本的采集和保存
在ELISA中标本可以是血清或血浆及其他体液,主要是血清和血浆,血清标本应及时检测,应清亮、无溶血、无菌,无过多的脂质,溶血标本会因为红细胞溶解时释放出具有过氧化物酶活性的物质。抗凝不完全的标本因含有纤维蛋白原而造成假阳性,最好不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。以HRP为标记的ELISA测定和细菌污染也会造成假阳性。一般来说1周内测定的标本可置于2~8℃(平均4℃),超过1周测定的需-20℃保存。若在冰箱中保存过久,可使本底加深。待测血清解冻后,应轻轻充分摇匀,且避免产生气泡,标本应避免反复冻融,其后果会使效价下降,所以待测标本要多次检测,最好少量分装冻存。ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间要避免交叉污染,要注意同一标本先做免疫后做生化。
试剂的准备
主要是第三代ELISA试剂,第四代试剂也已逐步推广,与第三代HIV-1/2试剂相比,检出时间提前3~9.1天,其优点在于可以同时检测抗原抗体,并缩短了窗口期检测时间。选择试剂不但要考虑灵敏度、特异性和精密度,还要注意稳定性、简便性和安全性。可以参考上级部门对试剂的评价结果来选择试剂,因为这具有权威性和公正性。
试剂从冰箱取出后应在室温下放置一段时间后使用,良好的ELISA板应该是吸附性能好、空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间性能相近。在ELISA中最好使用试剂盒自带的浓缩洗液,经1∶20稀释后使用。
在HIV初筛实验室,ELISA是常用的抗体筛查方法。ELISA是一种免疫测定,通常采用双抗原夹心法。其原理为预包被高纯度重组HIV(1+2型)抗原,可与样品中抗HIV抗体反应,同时加入HRP标记HIV(1+2型)抗原,然后用TMB底物作用显色。通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定样品中HIV抗体的存在与否。
ELISA试验的步骤对检测结果有很大的影响,每个步骤均应认真负责才能充分发挥ELISA灵敏和特异的优点。如不注意,有可能导致显色不全、花板等结果。现将操作中各个环节中要注意的问题及解决办法总结如下,以期提高试验质量。
标本的采集和保存
在ELISA中标本可以是血清或血浆及其他体液,主要是血清和血浆,血清标本应及时检测,应清亮、无溶血、无菌,无过多的脂质,溶血标本会因为红细胞溶解时释放出具有过氧化物酶活性的物质。抗凝不完全的标本因含有纤维蛋白原而造成假阳性,最好不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。以HRP为标记的ELISA测定和细菌污染也会造成假阳性。一般来说1周内测定的标本可置于2~8℃(平均4℃),超过1周测定的需-20℃保存。若在冰箱中保存过久,可使本底加深。待测血清解冻后,应轻轻充分摇匀,且避免产生气泡,标本应避免反复冻融,其后果会使效价下降,所以待测标本要多次检测,最好少量分装冻存。ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,标本间要避免交叉污染,要注意同一标本先做免疫后做生化。
试剂的准备
主要是第三代ELISA试剂,第四代试剂也已逐步推广,与第三代HIV-1/2试剂相比,检出时间提前3~9.1天,其优点在于可以同时检测抗原抗体,并缩短了窗口期检测时间。选择试剂不但要考虑灵敏度、特异性和精密度,还要注意稳定性、简便性和安全性。可以参考上级部门对试剂的评价结果来选择试剂,因为这具有权威性和公正性。
试剂从冰箱取出后应在室温下放置一段时间后使用,良好的ELISA板应该是吸附性能好、空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间性能相近。在ELISA中最好使用试剂盒自带的浓缩洗液,经1∶20稀释后使用。