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摘要：为了给无籽罗汉果优良品种的选育提供分子生物学依据，利用RAPD标记对28份罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株进行遗传背景分析。结果表明，罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景存在一定的丰富性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近。总的来说，罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株遗传背景的复杂性较低，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，丰富无籽罗汉果亲本的遗传背景。
关键词：罗汉果；二倍体；三倍体；遗传背景；RAPD
中图分类号： S567.903文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0241-03
收稿日期：2014-04-15
基金项目：国家科技支撑计划 （编号：2011BAI01B03）；国家自然科学基金 （编号：81373914）；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）
作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，博士，助理研究员，主要从事生药学研究。E-mail：wrc830612@163.com。罗汉果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属多年生藤本植物[1]，为我国南方特有的珍贵药用植物和甜料植物，主产于广西壮自治区永福、临桂、龙胜、兴安和融安等地[2]。罗汉果果实含多种甜苷，其中甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300～400倍，是一种综合性状极佳的天然甜味剂，广泛应用于食品、药品和保健品中，适合所有人群长期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血压患者的理想糖替代品[3-4]。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果实等部位的生物量和产量，其中三倍体罗汉果还具有无籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个罗汉果产业具有里程碑的意义[5]。罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结的果实即为无籽罗汉果。本研究利用RAPD分子标记技术[6-9]探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到28份材料：二倍体雄株7份，三倍体雌株21份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交获得（表1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，采集约10张健康成熟的叶片并混合成该份材料的样品，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。
1.2RAPD分析
采用改良CTAB（2×）法[10]提取罗汉果叶片的总DNA。
引物筛选：从材料中随机选出6份样品（包含2x、4x）进行引物筛选，从200条RAPD引物中筛选出20条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。20个RAPD引物名称、序列见表2。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：将扩增产物置于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不超过5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作为标准分子量对照，经溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察拍照、记录。
RAPD为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位置上有扩增条带记录为1，无扩增条带记录为0，构建0-1原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的并且长度在400～2 000 bp范围内的ISSR扩增条带才被记录。用AFLP-SURV version 1.0[12]计算材料间遗传距离D，按D=-lnⅠ计算Nei
关键词：罗汉果；二倍体；三倍体；遗传背景；RAPD
中图分类号： S567.903文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0241-03
收稿日期：2014-04-15
基金项目：国家科技支撑计划 （编号：2011BAI01B03）；国家自然科学基金 （编号：81373914）；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）
作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，博士，助理研究员，主要从事生药学研究。E-mail：wrc830612@163.com。罗汉果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属多年生藤本植物[1]，为我国南方特有的珍贵药用植物和甜料植物，主产于广西壮自治区永福、临桂、龙胜、兴安和融安等地[2]。罗汉果果实含多种甜苷，其中甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300～400倍，是一种综合性状极佳的天然甜味剂，广泛应用于食品、药品和保健品中，适合所有人群长期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血压患者的理想糖替代品[3-4]。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果实等部位的生物量和产量，其中三倍体罗汉果还具有无籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个罗汉果产业具有里程碑的意义[5]。罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结的果实即为无籽罗汉果。本研究利用RAPD分子标记技术[6-9]探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到28份材料：二倍体雄株7份，三倍体雌株21份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交获得（表1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，采集约10张健康成熟的叶片并混合成该份材料的样品，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。
1.2RAPD分析
采用改良CTAB（2×）法[10]提取罗汉果叶片的总DNA。
引物筛选：从材料中随机选出6份样品（包含2x、4x）进行引物筛选，从200条RAPD引物中筛选出20条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。20个RAPD引物名称、序列见表2。
琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：将扩增产物置于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不超过5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作为标准分子量对照，经溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察拍照、记录。
RAPD为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位置上有扩增条带记录为1，无扩增条带记录为0，构建0-1原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的并且长度在400～2 000 bp范围内的ISSR扩增条带才被记录。用AFLP-SURV version 1.0[12]计算材料间遗传距离D，按D=-lnⅠ计算Nei