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摘要：以海藻酸钠为包被材料，采用喷雾干燥法对羊大肠埃希菌灭活苗进行微囊化包被，以包埋率、平均粒径作为评价指标，通过单因素试验结合正交试验对微囊配方及工艺进行优化。结果表明，壁材浓度2%，芯材与壁材比例 1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%，进风温度200 ℃，出风温度90 ℃，蠕动泵速率70 mL/h，均质速率16 000 r/min时，所得产品粒径为（5.08±2.75） μm，包埋率达到75.23%，效果最佳。同时对产品进行体外释放试验，结果表明，所制备的微胶囊产品在人工胃液中2 h内未完全溶解，可抵御胃酸，具有肠溶性。
关键词：微胶囊；大肠埃希菌；海藻酸钠；包埋
中图分类号：R944.5；S858.265.1+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0177-03
收稿日期：2013-05-31
作者简介：杨力伟（1984—），男，新疆昌吉人，硕士，主要从事动物疾病防治工作。E-mail：94696181@qq.com。疫苗是预防和控制传染病的一种重要手段，我国研制的羊大肠埃希菌灭活苗是福尔马林和氢氧化铝苗，已用于生产，所采用的方法为注射法，具有良好的预防效果。但在使用中，注射过程往往会给动物造成较大应激，使动物生产性能下降，甚至因为操作或护理不当，引起动物死亡，造成较大的经济损失。
微胶囊[1]产品作为一种新型药物剂型广泛应用于口服疫苗给药中。口服疫苗[2]通过饮水或采食对动物进行预防接种，具有安全易行、实用方便、省时省力等优点，但是由于反刍动物消化道的复杂性，其强大的瘤胃微生物消化功能使得常规口服制剂若不经特殊处理，会在消化道内被降解而减弱或失去效果。因此，本研究致力于开发羊大肠埃希菌疫苗新剂型改变传统注射剂型，使免疫接种途径更加简单快捷，从而为开发反刍动物用大肠埃希菌口服疫苗奠定理论和实践基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株C83-1、C83-2、C83-3菌株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
1.1.2试验动物健康昆明白小鼠，购自新疆医科大学医学实验动物中心。
1.1.3试验试剂麦康凯琼脂（上海市医学化验所试剂厂），海藻酸钠（天津市光复精细化工研究所），胃蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司），吐温80（天津市盛淼精细化工有限公司），BCA蛋白测定试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。
1.1.4试验仪器PL2002电子天平[梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司]，ST-98B摇床（北京桑翌试验仪器研究所）、HG-76-6电热恒温两用箱（湖南省长沙市西区起重电器厂），MM-I型微量振荡器（江苏省姜堰市健华医疗器械有限公司），YC-015试验型喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司），KHB ST-360 全自动酶标仪。
1.2试验方法
1.2.1大肠埃希菌灭活苗的制备
1.2.1.1菌株的复苏取适量3种冻干粉，分别接种于普通肉汤培养基中，37 ℃恒温摇床130 r/min培养24 h。
1.2.1.2菌株的复壮取复苏菌液腹腔注射小鼠，待其死亡后，无菌剖取肝脏涂布于麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h，伊红美蓝培养基划线分纯2代，革兰氏染色，镜检。纯化后挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中，作为种子菌备用。
1.2.1.3菌种保存纯化镜检后，挑取单个菌落接种于半固体培养基中，37 ℃培养24 h，无菌甘油封存，于4 ℃保存备用。
1.2.1.4制苗用菌液制备将C83-1、C83-2、C83-3种子菌混合，按一定量接种于2%蛋白胨肉汤37 ℃恒温摇床中130 r/min培养24 h。
1.2.1.5菌液灭活检验按菌液总量的0.3%～0.45%加入甲醛溶液，经37 ℃灭活48 h，吸取一定量灭活菌液，接种于普通琼脂培养基上，37 ℃培养48 h，无菌生长。
1.2.1.6菌落计数吸取一定量的菌液以0.22 μm滤膜过滤除菌水作倍比稀释，于血细胞计数器上菌落计数。
1.2.1.7配苗经计数后，调整菌液含菌量作为羊大肠埃希菌灭活苗。
1.2.2羊大肠埃希菌的微囊化
1.2.2.1微囊化工艺流程取适量的羊大肠埃希菌灭活苗加入一定浓度的壁材溶液中，乳化均质，进行喷雾干燥，冷却，收集产品。
1.2.2.2壁材溶液配制海藻酸钠磁力搅拌溶解过夜、高压（115 ℃，10 min）备用。
1.2.2.3乳化均质海藻酸钠、乳化剂、保护剂及灭活抗原组织捣碎机高速乳化10 min，于均质机上A挡（10 000 r/min）保温均质30 min。
1.2.2.4喷雾干燥将乳状液置于喷雾干燥机内，进行喷雾干燥。
1.2.2.5微囊包被配方筛选通过单因素正交试验确定试验4个影响因素：壁材溶液浓度、芯材与壁材的比例、保护剂含量以及乳化剂含量。采用L9（34）正交表设计配方正交试验因素水平如表1所示。以包埋率和平均粒径为指标，确立最佳配方。
1.2.3微囊包被疫苗的参数测定
1.2.3.1微胶囊疫苗粒直径的测定Motic数码显微镜 1 000 倍视野下随机观察200个微胶囊颗粒形态，用 Adwanced 3.2软件测量微膠囊的粒径，取其平均值，并作出粒径分布图。
1.2.3.2微胶囊疫苗包埋率测定[3]精确称取0.01 g微胶囊，溶解于经0.22 μm滤膜过滤的灭菌水中，离心，洗去未包被的菌体；剩余产品精确定容至25 mL容量瓶中，用BCA蛋白试剂盒，以标准曲线法测定其蛋白含量，计算微胶囊包埋率：微胶囊包埋率=（总蛋白含量-未包埋蛋白含量）/总蛋白含量×100% 1.2.3.3微胶囊体外释放试验按照文献[4]中的附录XC溶出度测定法进行试验。称取0.10 g微胶囊产品，以50 mL人工肠液作为溶出介质，在 37 ℃ 恒温摇床150 r/min振荡，分别于0、15、30、45、60 min吸取1 mL介质溶液，同时补加等量的人工肠液，测定蛋白质含量，计算释放率。按上述方法加入人工胃液，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h时吸取溶液，同时补加等量的人工胃液，测定蛋白质含量，计算釋放率，同时，以未包被羊大肠埃希菌的微胶囊作对照组。
1.3试验数据统计分析
本试验所有数据均通过Excel 2003软件进行数据统计，以“平均值±标准差”表示。
2结果与分析
2.1羊大肠埃希菌微胶囊配方和工艺正交试验结果及分析
采用极差分析法对羊大肠埃希菌微胶囊配方和工艺正交试验数据进行计算和分析，结果如表3、表4所示。
由表3可见，影响喷雾干燥微胶囊包埋率试验因素的主次顺序为乳化剂含量>芯材 ∶壁材>保护剂含量>壁材浓度。该指标越大越好，因此最优配方为：壁材浓度2%，芯材 ∶壁材1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%。影响微胶囊粒直径指标的主次顺序为乳化剂含量>芯材 ∶壁材>壁材浓度>保护剂含量，该指标越小越好，因此最佳配方为：壁材浓度2%，芯材 ∶壁材1 ∶1，保护剂含量2%，乳化剂含量4%。
2.3微胶囊包埋率
标准曲线回归方程为y=20.807x-0.150 4（r2=0.992 3），计算出产品包埋率为75.23%。
2.4微胶囊体外释放试验结果
由图4可以看出，在15 min时，人工肠液中的蛋白质含量达到峰值，说明此时微胶囊大多数已经崩解，暴露出菌体抗原，因而此时蛋白含量高；在15 min以后，由于胶囊已被肠液溶解，蛋白含量变化不大。
由图5看出，在2 h内，人工胃液中蛋白含量变化不大，说明微胶囊产品在2 h内未被完全溶解，菌体蛋白没有完全暴露。
微胶囊产品在人工肠液中15～30 min内完全崩解，释放疫苗，说明具有肠溶性；在人工胃液中2 h内多数未被胃液消化，说明能够耐胃酸（图4、图5）。
3结论与讨论
通过口服疫苗进行免疫预防接种是实现局部黏膜免疫的主要和重要途径，而胃肠道黏膜免疫系统则是口服疫苗产生免疫力的物质基础[5]。口服后体内的摄取位点主要有4个，即小肠绒毛顶端、小肠内的巨噬细胞、肠上皮细胞、派尔集合淋巴结（peyers patches，PP结）上皮。PP结分布于胃肠道，是最大的黏膜相关淋巴组织，它与肠腔仅隔一层上皮细胞，其肠黏膜诱导部位的特异性上皮细胞（M细胞）可摄取肠腔里的抗原物质[6]。
有研究表明，粒径在10 μm以下的颗粒都可被肠道PP结内的M细胞摄取吸收，其中5～10 μm的微球滞留在该结内释放药物；而小于5 μm的微球则通过PP结进入淋巴循环，说明粒径越小，吸收越好[7-8]。例如，球虫疫苗经海藻酸包被后，拌料口服，有较好的效果。本试验制得的微胶囊产品粒径小且具有耐胃酸性和良好肠溶性，有利于抗原物质在肠腔中的吸收。
本试验最终确定以海藻酸钠为包被材料制作羊大肠埃希菌微胶囊的最佳配方及最优工艺结果如下：壁材海藻酸钠溶
液浓度2%，芯材与壁材比例1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%；进风温度200 ℃，出风温度90 ℃，蠕动泵速度 70 mL/h，均质速率16 000 r/min。所得产品平均粒径为 （5.08±2.75） μm，包埋率达到75.23%。所制备的微胶囊产品可抵御胃酸，具有肠溶性。
参考文献：
[1]Mark H F. Encyclopedia of polymer science and technology[M]. 2nd ed. New York：Wiley Press，1987：724.
[2]孙翰昌，杨帆. 肠型点状气单胞菌口服疫苗微粒的制备及体外释放研究[J]. 水产科学，2008，27（12）：658-661.
[3]陈河如，邹湘辉，马民智. 头孢唑啉钠-海藻酸钠微胶囊的制备及抗菌作用[J]. 应用化学，2007，24（12）：1354-1358.
[4]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典：二部[M]. 北京：化学工业出版社，2005.
[5]马兴元. 动物口服疫苗研究进展[J]. 动物医学进展，1998，2（2）：2-5.
[6]项琪，宁黎丽. 口服疫苗微球化研究进展[J]. 中国现代应用药学杂志：2001，18（2）：4-7.
[7]陈浮，张志荣，黄园. 口服疫苗给药系统的研究进展[J]. 华西药学杂志，2007，22（1）：69-71.
[8]Shakweh M，Besnard M，Nicolas V，et al. Poly （lactide-co-glycolide） particles of different physicochemical properties and their uptake by peyers patches in mice[J]. Eur J Pharm Biopharma，2005，61（1/2）：1-13.陈爱华，姚国兴，吴杨平，等. 不同地理种群红壳色文蛤的杂种优势[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：180-183.
关键词：微胶囊；大肠埃希菌；海藻酸钠；包埋
中图分类号：R944.5；S858.265.1+2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0177-03
收稿日期：2013-05-31
作者简介：杨力伟（1984—），男，新疆昌吉人，硕士，主要从事动物疾病防治工作。E-mail：94696181@qq.com。疫苗是预防和控制传染病的一种重要手段，我国研制的羊大肠埃希菌灭活苗是福尔马林和氢氧化铝苗，已用于生产，所采用的方法为注射法，具有良好的预防效果。但在使用中，注射过程往往会给动物造成较大应激，使动物生产性能下降，甚至因为操作或护理不当，引起动物死亡，造成较大的经济损失。
微胶囊[1]产品作为一种新型药物剂型广泛应用于口服疫苗给药中。口服疫苗[2]通过饮水或采食对动物进行预防接种，具有安全易行、实用方便、省时省力等优点，但是由于反刍动物消化道的复杂性，其强大的瘤胃微生物消化功能使得常规口服制剂若不经特殊处理，会在消化道内被降解而减弱或失去效果。因此，本研究致力于开发羊大肠埃希菌疫苗新剂型改变传统注射剂型，使免疫接种途径更加简单快捷，从而为开发反刍动物用大肠埃希菌口服疫苗奠定理论和实践基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌株C83-1、C83-2、C83-3菌株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
1.1.2试验动物健康昆明白小鼠，购自新疆医科大学医学实验动物中心。
1.1.3试验试剂麦康凯琼脂（上海市医学化验所试剂厂），海藻酸钠（天津市光复精细化工研究所），胃蛋白酶（上海蓝季科技发展有限公司），吐温80（天津市盛淼精细化工有限公司），BCA蛋白测定试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。
1.1.4试验仪器PL2002电子天平[梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司]，ST-98B摇床（北京桑翌试验仪器研究所）、HG-76-6电热恒温两用箱（湖南省长沙市西区起重电器厂），MM-I型微量振荡器（江苏省姜堰市健华医疗器械有限公司），YC-015试验型喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司），KHB ST-360 全自动酶标仪。
1.2试验方法
1.2.1大肠埃希菌灭活苗的制备
1.2.1.1菌株的复苏取适量3种冻干粉，分别接种于普通肉汤培养基中，37 ℃恒温摇床130 r/min培养24 h。
1.2.1.2菌株的复壮取复苏菌液腹腔注射小鼠，待其死亡后，无菌剖取肝脏涂布于麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h，伊红美蓝培养基划线分纯2代，革兰氏染色，镜检。纯化后挑取单个菌落接种于普通肉汤培养基中，作为种子菌备用。
1.2.1.3菌种保存纯化镜检后，挑取单个菌落接种于半固体培养基中，37 ℃培养24 h，无菌甘油封存，于4 ℃保存备用。
1.2.1.4制苗用菌液制备将C83-1、C83-2、C83-3种子菌混合，按一定量接种于2%蛋白胨肉汤37 ℃恒温摇床中130 r/min培养24 h。
1.2.1.5菌液灭活检验按菌液总量的0.3%～0.45%加入甲醛溶液，经37 ℃灭活48 h，吸取一定量灭活菌液，接种于普通琼脂培养基上，37 ℃培养48 h，无菌生长。
1.2.1.6菌落计数吸取一定量的菌液以0.22 μm滤膜过滤除菌水作倍比稀释，于血细胞计数器上菌落计数。
1.2.1.7配苗经计数后，调整菌液含菌量作为羊大肠埃希菌灭活苗。
1.2.2羊大肠埃希菌的微囊化
1.2.2.1微囊化工艺流程取适量的羊大肠埃希菌灭活苗加入一定浓度的壁材溶液中，乳化均质，进行喷雾干燥，冷却，收集产品。
1.2.2.2壁材溶液配制海藻酸钠磁力搅拌溶解过夜、高压（115 ℃，10 min）备用。
1.2.2.3乳化均质海藻酸钠、乳化剂、保护剂及灭活抗原组织捣碎机高速乳化10 min，于均质机上A挡（10 000 r/min）保温均质30 min。
1.2.2.4喷雾干燥将乳状液置于喷雾干燥机内，进行喷雾干燥。
1.2.2.5微囊包被配方筛选通过单因素正交试验确定试验4个影响因素：壁材溶液浓度、芯材与壁材的比例、保护剂含量以及乳化剂含量。采用L9（34）正交表设计配方正交试验因素水平如表1所示。以包埋率和平均粒径为指标，确立最佳配方。
1.2.3微囊包被疫苗的参数测定
1.2.3.1微胶囊疫苗粒直径的测定Motic数码显微镜 1 000 倍视野下随机观察200个微胶囊颗粒形态，用 Adwanced 3.2软件测量微膠囊的粒径，取其平均值，并作出粒径分布图。
1.2.3.2微胶囊疫苗包埋率测定[3]精确称取0.01 g微胶囊，溶解于经0.22 μm滤膜过滤的灭菌水中，离心，洗去未包被的菌体；剩余产品精确定容至25 mL容量瓶中，用BCA蛋白试剂盒，以标准曲线法测定其蛋白含量，计算微胶囊包埋率：微胶囊包埋率=（总蛋白含量-未包埋蛋白含量）/总蛋白含量×100% 1.2.3.3微胶囊体外释放试验按照文献[4]中的附录XC溶出度测定法进行试验。称取0.10 g微胶囊产品，以50 mL人工肠液作为溶出介质，在 37 ℃ 恒温摇床150 r/min振荡，分别于0、15、30、45、60 min吸取1 mL介质溶液，同时补加等量的人工肠液，测定蛋白质含量，计算释放率。按上述方法加入人工胃液，分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h时吸取溶液，同时补加等量的人工胃液，测定蛋白质含量，计算釋放率，同时，以未包被羊大肠埃希菌的微胶囊作对照组。
1.3试验数据统计分析
本试验所有数据均通过Excel 2003软件进行数据统计，以“平均值±标准差”表示。
2结果与分析
2.1羊大肠埃希菌微胶囊配方和工艺正交试验结果及分析
采用极差分析法对羊大肠埃希菌微胶囊配方和工艺正交试验数据进行计算和分析，结果如表3、表4所示。
由表3可见，影响喷雾干燥微胶囊包埋率试验因素的主次顺序为乳化剂含量>芯材 ∶壁材>保护剂含量>壁材浓度。该指标越大越好，因此最优配方为：壁材浓度2%，芯材 ∶壁材1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%。影响微胶囊粒直径指标的主次顺序为乳化剂含量>芯材 ∶壁材>壁材浓度>保护剂含量，该指标越小越好，因此最佳配方为：壁材浓度2%，芯材 ∶壁材1 ∶1，保护剂含量2%，乳化剂含量4%。
2.3微胶囊包埋率
标准曲线回归方程为y=20.807x-0.150 4（r2=0.992 3），计算出产品包埋率为75.23%。
2.4微胶囊体外释放试验结果
由图4可以看出，在15 min时，人工肠液中的蛋白质含量达到峰值，说明此时微胶囊大多数已经崩解，暴露出菌体抗原，因而此时蛋白含量高；在15 min以后，由于胶囊已被肠液溶解，蛋白含量变化不大。
由图5看出，在2 h内，人工胃液中蛋白含量变化不大，说明微胶囊产品在2 h内未被完全溶解，菌体蛋白没有完全暴露。
微胶囊产品在人工肠液中15～30 min内完全崩解，释放疫苗，说明具有肠溶性；在人工胃液中2 h内多数未被胃液消化，说明能够耐胃酸（图4、图5）。
3结论与讨论
通过口服疫苗进行免疫预防接种是实现局部黏膜免疫的主要和重要途径，而胃肠道黏膜免疫系统则是口服疫苗产生免疫力的物质基础[5]。口服后体内的摄取位点主要有4个，即小肠绒毛顶端、小肠内的巨噬细胞、肠上皮细胞、派尔集合淋巴结（peyers patches，PP结）上皮。PP结分布于胃肠道，是最大的黏膜相关淋巴组织，它与肠腔仅隔一层上皮细胞，其肠黏膜诱导部位的特异性上皮细胞（M细胞）可摄取肠腔里的抗原物质[6]。
有研究表明，粒径在10 μm以下的颗粒都可被肠道PP结内的M细胞摄取吸收，其中5～10 μm的微球滞留在该结内释放药物；而小于5 μm的微球则通过PP结进入淋巴循环，说明粒径越小，吸收越好[7-8]。例如，球虫疫苗经海藻酸包被后，拌料口服，有较好的效果。本试验制得的微胶囊产品粒径小且具有耐胃酸性和良好肠溶性，有利于抗原物质在肠腔中的吸收。
本试验最终确定以海藻酸钠为包被材料制作羊大肠埃希菌微胶囊的最佳配方及最优工艺结果如下：壁材海藻酸钠溶
液浓度2%，芯材与壁材比例1 ∶3，保护剂含量4%，乳化剂含量6%；进风温度200 ℃，出风温度90 ℃，蠕动泵速度 70 mL/h，均质速率16 000 r/min。所得产品平均粒径为 （5.08±2.75） μm，包埋率达到75.23%。所制备的微胶囊产品可抵御胃酸，具有肠溶性。
参考文献：
[1]Mark H F. Encyclopedia of polymer science and technology[M]. 2nd ed. New York：Wiley Press，1987：724.
[2]孙翰昌，杨帆. 肠型点状气单胞菌口服疫苗微粒的制备及体外释放研究[J]. 水产科学，2008，27（12）：658-661.
[3]陈河如，邹湘辉，马民智. 头孢唑啉钠-海藻酸钠微胶囊的制备及抗菌作用[J]. 应用化学，2007，24（12）：1354-1358.
[4]中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典：二部[M]. 北京：化学工业出版社，2005.
[5]马兴元. 动物口服疫苗研究进展[J]. 动物医学进展，1998，2（2）：2-5.
[6]项琪，宁黎丽. 口服疫苗微球化研究进展[J]. 中国现代应用药学杂志：2001，18（2）：4-7.
[7]陈浮，张志荣，黄园. 口服疫苗给药系统的研究进展[J]. 华西药学杂志，2007，22（1）：69-71.
[8]Shakweh M，Besnard M，Nicolas V，et al. Poly （lactide-co-glycolide） particles of different physicochemical properties and their uptake by peyers patches in mice[J]. Eur J Pharm Biopharma，2005，61（1/2）：1-13.陈爱华，姚国兴，吴杨平，等. 不同地理种群红壳色文蛤的杂种优势[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：180-183.