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摘要细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖,人们借以观察细胞的生长、繁殖;细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。对乳鼠心肌细胞的培养进行理论和实验探讨。
关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法
中图分类号R3文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)061-0115-01
1材料
所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。
取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。
物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。
以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入,后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开,把瓶皿摆好,再用一个瓶皿装酒精棉球。
2培养方法
乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞,培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法,我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小,比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性,但这个浓度消化所需时间较长,所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速贴壁1h,除去成纤维细胞,达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。
事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用,提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭(0.1%)泡纱布(用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得),消毒地面(1:500的84液),用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
具体方法:
1)把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2-3天的SD大鼠,放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定(位置摆正),用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱碘,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2)取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。
3)用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶,然后将其中少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入三角烧瓶中(可用剪刀刮入),再用剩余胰酶刷净烧杯。
4)把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34-35℃)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意监控。
5)温度达到34℃时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。
6)10分钟后,把三角烧瓶取下,磁力搅拌器关上,用一个吸管轻轻吹打(使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来),这个吸管①用后固定放在一个离心管中,以后每次消化后取下都用其吹打几下,第一次上清弃去,然后向两个1号管分别倒入2ml上清(尽量不要把组织倒出,也不要剩液太多,以免消化下的细胞重复消化造成损伤),用另一个吸管。②混匀配平两个管(即两个管水平高度相同),轻轻吹打,以免损坏细胞。
7)接着把这两个离心管放入离心机中,调10分钟,800或1000转,打开关。
8)同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶,继续消化8分钟,注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。
9)取下三角烧瓶,仍用1号吸管吹打,后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清,取出两个离心后的1号管,把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉,后向其中一管加入4ml的DMEM液,用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中,把管底的沉淀细胞洗下来,把液体全部移入其中一管,三个管(1个1号管,两个2号管)配平,放入离心管中,离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶,放入三角烧瓶中,继续消化(注意控制温度,达34℃时计时)。
10)消化到4次左右,吹打均匀后,吸一滴滴在载玻片上,拿到镜下观察消化情况,决定消化次数。
11)离心2次的吸管,放在试管架上,待离心过程全部完事后,把各管上清液倒掉,在各管加上3ml(不用精确,大致这样)DMEM液,记住共加入多少DMEM液的量,换吸管(3号)把各管底细胞块吸下吹打均匀后,移入50ml烧杯中,然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中,加入小牛血清及抗生素,换吸管(4号)吹打均匀。
12)取出24孔培養板,一个人吹打,另一个人用加样器加药。封盖时过火,盖上盖,放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。(生物秀实验频道www.bbioo.com)(24孔板,每孔最多加2ml,一般加液时每孔加1-1.5ml)。
3讨论
心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形,大约在一天左右基本贴壁,此时细胞伸出伪足,伪足在镜下为纤维状条索,细胞胞体则呈现不规则形状,如多角形,部分细胞有聚集倾向,细胞搏动效果较好,DMEM培养基在初始培养时为深红色,两天后变为淡黄色,应该是营养成分下降的表现,也说明细胞生长状况良好。
关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法
中图分类号R3文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)061-0115-01
1材料
所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。
取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。
物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。
以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。先把物品递入,后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精灯打开,把瓶皿摆好,再用一个瓶皿装酒精棉球。
2培养方法
乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞,培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法,我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小,比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性,但这个浓度消化所需时间较长,所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差速贴壁1h,除去成纤维细胞,达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。
事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用,提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。新洁尔灭(0.1%)泡纱布(用10ml5%的新洁尔灭加水至500ml即得),消毒地面(1:500的84液),用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
具体方法:
1)把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2-3天的SD大鼠,放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定(位置摆正),用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱碘,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。
2)取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。
3)用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶,然后将其中少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入三角烧瓶中(可用剪刀刮入),再用剩余胰酶刷净烧杯。
4)把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34-35℃)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意监控。
5)温度达到34℃时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。
6)10分钟后,把三角烧瓶取下,磁力搅拌器关上,用一个吸管轻轻吹打(使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来),这个吸管①用后固定放在一个离心管中,以后每次消化后取下都用其吹打几下,第一次上清弃去,然后向两个1号管分别倒入2ml上清(尽量不要把组织倒出,也不要剩液太多,以免消化下的细胞重复消化造成损伤),用另一个吸管。②混匀配平两个管(即两个管水平高度相同),轻轻吹打,以免损坏细胞。
7)接着把这两个离心管放入离心机中,调10分钟,800或1000转,打开关。
8)同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶,继续消化8分钟,注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。
9)取下三角烧瓶,仍用1号吸管吹打,后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清,取出两个离心后的1号管,把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉,后向其中一管加入4ml的DMEM液,用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中,把管底的沉淀细胞洗下来,把液体全部移入其中一管,三个管(1个1号管,两个2号管)配平,放入离心管中,离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶,放入三角烧瓶中,继续消化(注意控制温度,达34℃时计时)。
10)消化到4次左右,吹打均匀后,吸一滴滴在载玻片上,拿到镜下观察消化情况,决定消化次数。
11)离心2次的吸管,放在试管架上,待离心过程全部完事后,把各管上清液倒掉,在各管加上3ml(不用精确,大致这样)DMEM液,记住共加入多少DMEM液的量,换吸管(3号)把各管底细胞块吸下吹打均匀后,移入50ml烧杯中,然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中,加入小牛血清及抗生素,换吸管(4号)吹打均匀。
12)取出24孔培養板,一个人吹打,另一个人用加样器加药。封盖时过火,盖上盖,放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。(生物秀实验频道www.bbioo.com)(24孔板,每孔最多加2ml,一般加液时每孔加1-1.5ml)。
3讨论
心肌细胞刚接种时形状为圆形或椭圆形,大约在一天左右基本贴壁,此时细胞伸出伪足,伪足在镜下为纤维状条索,细胞胞体则呈现不规则形状,如多角形,部分细胞有聚集倾向,细胞搏动效果较好,DMEM培养基在初始培养时为深红色,两天后变为淡黄色,应该是营养成分下降的表现,也说明细胞生长状况良好。