以PI3K/Akt/mTOR信号转导通路为靶点，观察PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAD001对体外培养血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的影响，并检测PI3K/Akt/mTOR信号轴中效应分子以探讨血管瘤消长的分子机制。
方法采用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞、传代培养，并用第Ⅷ凝血因子相关抗原对其鉴定。待细胞处于对数生长期，使用无血清培养孵育48h行同步化处理后，分别加入RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002作为干预组，加入完全内皮细胞培养基作为空白对照组。以上4组继续孵育24h后收集细胞，采用蛋白免疫印迹方法检测各组细胞p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达，流式细胞仪检测各组细胞的周期分布及凋亡率，分析p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达水平与血管瘤内皮细胞周期及凋亡变化的相关性。
结果1．RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002干预24 h后，内皮细胞凋亡率分别为(13.80±1.73)%、(15.03±1.05)%、(36.06±2.67)%，较对照组(3.90±0.20)%有明显升高，差异具有统计学意义(t＝－9.82，－18.03，－20.82，P<0.01)，且RAD001＋LY294002组凋亡率显著高于对照组、LY294002组、RAD001组(t＝－20.82，－12.12，－12.7，P<0.01)；G0/G1期细胞比例分别为(74.29±1.59)%、(74.57±0.59)%、(82.28±3.01)%，较对照组(67.15±1.49)%有明显升高，差异具有统计学意义(t＝－5.67，－8.02，－7.79，P<0.01)，且RAD001＋LY294002组高于对照组、LY294002组、RAD001组(t＝－7.79，－4.35，－4.06，P<0.05)。2.蛋白免疫印迹检测显示，RAD001干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达分别为(0.75±0.04)、(0.54±0.08)、(1.50±0.34)，较对照组(0.43±0.08)、(0.27±0.04)、(0.84±0.17)增加，差异具有统计学意义(t＝－6.13，－5.49，－3.03，P<0.05)；p-mTOR(0.40±0.04)比对照组(0.77±0.07)明显降低，差异具有统计学意义(t＝7.91，P<0.01)。LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为(0.31±0.08)、(0.26±0.04)、(0.78±0.18)、(0.42±0.05)，与对照组比较，蛋白表达有一定下降趋势，但差异无统计学意义(t＝2.01、0.23、0.41、6.75，P>0.05)；RAD001＋LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为(0.32±0.09)、(0.23±0.04)、(0.50±0.13)、(0.27±0.03)，与对照组比较，p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(t＝2.77、10.97，P<0.05)，p-Akt、p-ERK蛋白表达差异无统计学意义(t＝1.70、1.10，P>0.05)，与LY294002组，p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(t＝4.42，P<0.05), p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达无统计学意义(t＝－0.15、0.92、2.16，P>0.05)，与RAD001组比较，均有明显降低，差异具有统计学意义(t＝7.37、6.47、4.75、4.87，P<0.01)。
结论mTOR抑制剂RAD001可引起p-Akt、p-ERK及p-eIF4E的负反馈激活；RAD001＋LY294002对体外培养血管瘤内皮细胞的干预效果优于单独使用RAD001或LY294002，且可避免RAD001引起的负反馈激活。