论文部分内容阅读
[摘要]外源性牙面黑色素沉着（Extrinsic black tooth stain，EBS）是沉积在牙齿上不连续的黑点或黑褐色条带，是一种特殊的菌斑，机械清除后很容易复发。其病因包括细菌，宿主和饮食，近年来关于EBS和铁代谢的研究日益增多。有研究显示EBS可能和微生态失调有关，发现的主要致病菌包括产黑色素类厌氧杆菌和放线菌。EBS患者的唾液具有较高的钙浓度和较强的缓冲能力，食用富含色素和铁的食物会促进EBS的产生。喷砂治疗是目前报道的机械清洁EBS有效且损伤较小的方法，此外，还可以结合化学、光疗、乳铁蛋白和益生菌微生物疗法治疗和减少EBS复发。
[关键词]外源性牙面黑色素沉着;细菌;铁;饮食;唾液
[中图分类号]R781.4+6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2021）08-0186-04
Etiology and Treatment Research Progress on Extrinsic Black Tooth Stain
DING Hui1， ZHANG Shi-nan2， LIU Juan1， ZHOU Ni1
（1.Department of Pediatric Dentistry;2.Department of Preventive Dentistry， Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650106， Yunnan， China）
Abstract： Extrinsic black stain （EBS） is characterized by discrete dark dots or lines on the tooth surface， which is a special plaque. It is easy to relapse after mechanical removal. Its etiology is related to bacteria， host and diet. Recently， increasing numbers of investigations which focus on the interaction between EBS and iron metabolism have been carried out. Studies have suggested that EBS could relate to dysbacteriosis. Currently， the main pathogenic bacteria reported were black-pigmented anarobic bod and actinomycetes. The saliva of EBS patients has high calcium concentration and strong buffer capacity， and eating foods rich in pigment and iron can promote EBS production. Sandblasting treatment is one of the mechanical cleaning methods that causes less damage to tooth structure. In addition， chemotherapy， phototherapy， lactoferrin， and probiotic microbial therapy can be used comprehensively to prevent the recurrence of EBS.
Key words： extrinsic black tooth stain; bacteria; iron; diet; salivary; treatment
外源性牙面黑色素沉著[1]（Extrinsic black tooth stain，EBS）指的是沉积在牙齿上平齐龈缘的不连续的黑点或黑褐色条带，很少延伸至牙冠的颈三分之一以上，也可存在于牙面的窝沟点隙中。不同于其他类型的色素，EBS是一种特殊牙菌斑，与其他牙菌斑相比，EBS菌群简单，微生物多样性减少，并含有微量的钙、镁、铁、铜和锌，容易钙化[2-3]。因EBS可牢固地黏附在牙齿上，日常的口腔护理（如：牙刷和牙膏的使用）很难将其完全清除，在口腔卫生良好的情况下也容易产生EBS，且清除后很容易复发，极大地影响了美观和口腔清洁[4]。EBS的病因机制尚未完全清楚，本文围绕细菌、宿主和饮食三个方面对EBS的病因展开讨论，介绍EBS治疗的新进展，为今后预防和治疗EBS提供参考。
1 EBS的病因
早期文献表明[5]，EBS是一种黑色不溶性铁化合物，由细菌产生的硫化氢与铁相互作用形成。Zhang等[6]通过电感耦合等离子体质谱法证实了EBS中铁的存在。同时基于16S rRNA扩增子测序结果预测EBS微生物群落功能，在测试的253条基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG）途径中，EBS和非EBS患者的牙菌斑之间有56条KEGG途径不同，其中某些途径可能与铁代谢有关。对于绝大多数微生物来说， 铁元素是其生长所必须的一种重要元素。它作为辅因子在生化代谢反应、电子传递等生命活动过程中发挥着极其重要的作用[7]。Zhang等[6]在分析EBS与铁和微生物之间的关系时，提出了两个假说。第一，EBS是微生物代谢的结果，微生物代谢产生铁化合物形成了EBS;第二，环境因素（例如饮食）通过化学反应产生EBS，同时改变EBS中的微生物群落。牙齿上的沉积物能为细菌提供营养物质，细菌的代谢产物也会参与EBS的形成。 1.1 细菌：革兰氏阳性杆菌，特别是衣氏放线菌和内氏放线菌是EBS的主要可培养微生物[8]。Saba等[9]研究发现，口腔内有放线菌属的人患EBS的风险比没有的人高四倍。当唾液或牙龈液中铁浓度大于10?mol/L时，细菌繁殖速度加快，放线菌代谢产生的硫化氢和铁生成不溶性的硫化铁[10]。另外，一些研究也发现[8] Candidate_division_TM7菌属含量低于非EBS组（P<0.05），Candidate_division_TM7能调控口腔生物膜的形成，还可以与其他微生物间相互作用影响口腔微生物群落组成[11]，但Candidate_division_TM7菌属对EBS的影响机制仍不清楚。
张明珠等[12]通过采集牙菌斑样本研究产黑色素类厌氧杆菌（Black- Pigmented Anarobic Bod， BPB）与EBS的关系，结果发现EBS患者的牙菌斑样本中包括牙龈卟啉菌 （Porphyromonas gingivalis， P.g）、牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis，P.e）和中间普氏菌 （Prevotella intermedicus， P.i）检出率明显高于非EBS患者（P<0.05）。铁是P.g的重要生长因子，P.g通过调节铁吸收机制以及细胞内铁结合蛋白的活性来储存铁。多余的铁被储存在细胞表面，会使菌落呈特征性黑色。亚铁血红素μ-oxo二聚体在菌体表面的沉积是P.g黑色素的主要来源[13]。Smalley等[14]研究发现P.g精氨酸特异牙龈蛋白酶-R与氧化血红蛋白结合可以形成高铁血红蛋白，促进血红素沉积。高铁血红蛋白被赖氨酸特异牙龈蛋白酶K降解后导致原卟啉铁的释放，促进黑色素形成。P.i和P.n在低pH值环境中可形成并降解高铁血红蛋白产生卟啉铁，低pH值又可导致不溶性卟啉铁的沉积，从而促进色素沉积。
Li等[15]应用基于Dirichlet多项式混合的聚类分析方法来研究EBS患者口腔微生物菌落类型，发现纤毛菌属和梭杆菌属与EBS形成相关。张丽菊[16]采用454焦磷酸测序技术对EBS组和非EBS组乳牙龈上菌斑和非刺激性唾液微生物进行全面分析，发现了EBS组唾液微生物门水平覆盖少于非EBS组。菌斑和唾液组间与健康人群相比较均有优势菌群，与EBS相关的菌斑优势菌群有链球菌属，罗氏菌属，马赛菌属和寡养单胞菌属等10个菌属。唾液优势菌群有韦荣球菌属，卟啉菌属，梭杆菌属和二氧化碳噬纤维菌属等13个优势菌属，表明生态失调可能是EBS的一个病因。
1.2 宿主：Ariq Noorkhakim等[17]研究发现EBS儿童唾液中钙、磷含量明显高于非EBS儿童，高浓度的钙和磷能增加唾液缓冲能力，对不耐酸的放线菌属生长有促进作用，进而影响菌斑的细菌组成，这可能解释了EBS患者放线菌的优势。关于EBS和唾液pH值之间的关系，现在的研究结果不一致。Katica Prskalo等[3]研究发现EBS患者唾液pH值低于非EBS患者。在酸性条件下，表面牙齿容易脱矿，对铁的吸收会增加。然而Claudia等[18]通过检测EBS组和非EBS组的非刺激性唾液，发现EBS组pH的平均值高于对照组（8.0±0.5 vs.7.2±0.7）。较高的pH值会降低铁的溶解度，同时减少细菌对铁的利用率[7]。唾液的理化性质会随着年龄、情绪、疾病、口腔环境和饮食习惯等的变化而变化[19]，在一定程度上，唾液也可以反映身体的健康状态。关于唾液和EBS之间的关系还有待进一步研究。
1.3 食物：据报道，食用富含色素[20]的饮料、蔬菜和中草药，进食酸性食物[21]，以及饮用高pH值及含铁量高的水[18]会增加患EBS的风险。多酚是某些蔬菜和饮料，如：茶和咖啡的组分，对非血红素铁的吸收具有明显的抑制作用，可以在富脯蛋白的介导下与金属阳离子发生反应，产生色素[16]。Garcia Martin[22] 等人的横断面研究发现EBS与母亲妊娠期的补铁量及婴儿期的铁摄入量有关，不同成分和浓度的铁补充剂导致EBS的程度不同[23]。经常食用富含铁的食物如蔬菜、豆类、乳制品、鸡蛋会促进BPB的发展，增加EBS的患病率[1]。有流行病学调查显示肺炎和EBS的患病率有关[21]，原因可能是抗生素的频繁使用影响了口腔的菌群平衡，致使BPB增加，导致色素沉积[1]。
唾液中的乳铁蛋白（Lactoferrin， Lf）有很强的结合铁的能力，与细菌竞争Fe3+，抑制细菌生长繁殖[24]。Mesonjesi[25]在临床上发现，EBS患者每天除了饮用牛奶外，还食用大量奶酪，牛奶中含有大量的牛乳铁蛋白，能结合唾液中的铁，他推测EBS可能是铁饱和的牛乳铁蛋白，铁代谢紊乱可能会导致EBS，EBS可能是缺铁性贫血或铁过载的征兆。Ameliana Nuraeni等[26]通过检测定期喝牛奶的EBS儿童唾液中铁元素的含量，发现EBS儿童唾液中铁的浓度较非EBS儿童高，铁可以为口腔细菌提供必需的营养，铁的浓度也可以调节口腔唾液微生物群落的组成[27]。牛奶的铁含量为4%～25%，经常喝牛奶会导致铁沉积在牙齿上，建议喝完牛奶后立即漱口，避免产生EBS。牛奶中含有钙盐和磷盐，体内的亚铁与其结合会形成不溶性化合物，影响铁的吸收利用，所以缺铁性贫血的患者不宜饮用牛奶。Lee等[28]研究發现在茶水中添加牛奶有助于预防牙齿着色，牛奶中80%的蛋白质是酪蛋白，可以结合茶多酚，降低茶叶对牙齿着色能力。牛奶和EBS之间的相关性以及如何更好地发挥牛奶在口腔卫生保健中的作用都值得再思考。
口腔微生态是一个极其复杂的生态系统，由多个不同的微环境组成，不同的微环境之间会相互影响，微生物在口腔中通过复杂的聚集、竞争、拮抗及协同等相互作用维持口腔生态系的动态平衡。当微生态失衡，唾液的参数、饮食习惯和口腔卫生习惯发生改变，口腔内的稳态被破坏[29-30]，就可能会产生EBS。 2 EBS的治疗
根据EBS的形成机制和病因，目前治疗EBS的方法可以分为以下几类。
2.1 机械清除：有研究比较了超声洁治、喷砂洁治和矽粒子抛光去除牙面色素的效果，结果发现超声洁治组与气流喷砂组去除色素较为彻底，而矽粒子抛光组的牙面残留明显色素[31]。喷砂治疗使用喷砂机或装有喷砂装置的洁牙机通过特制手柄将混合高压和混合气的喷砂粉喷向牙面，能更好地清除牙齿死角处的色素，术者疲劳感小，耗时更少，洁治效率更高，对牙齿损伤更小[32-33]。
2.2 化学抑制：有研究发现从蛋壳中分离提取出的溶菌酶具有抗菌作用，抑制牙菌斑的形成。蛋白水解酶可水解唾液获得性膜及牙菌斑上的蛋白成分，从而有效去除结合在上面的色素。将它们制成含有生物酶的牙膏，可以用来减少牙面外源性色素[34]。有一项10年随访的病例报道显示，使用过氧化脲和过氧化氢对EBS进行漂白能减少复发[35]，过氧化物不仅有细胞毒性，还能抑制某些微生物的生长和代谢，特别是厌氧微生物，从而清除和抑制EBS的产生，保持口腔清洁和美观。
2.3 光动力疗法：光动力疗法（Photodynamic therapy， PDT）是利用低能量激光激活光敏剂产生的光动力效应对疾病进行诊断和治疗的一种新技术[36]。Larissa等[37]采用PDT对一名10岁的全口牙都有EBS男孩进行治疗，治疗后BPB水平显著降低，EBS消失，随访7个月无复发。将PDT用于控制细菌、病毒、真菌所致感染的化学疗法被称为光动力抗菌疗法（Antimicrobial photodynamic therapy， aPT）。Albelda等[38]通过记录EBS患者经过aPT治疗后，EBS的优势细菌的含量有所下降。治疗没有改变EBS的复发时间，但减少了EBS复发的面积和颜色。
2.4 微生物疗法：虽然EBS可以通过机械方法清除，但口腔内的微环境没有改变，EBS清除后容易复发[39]，有研究采用微生物疗法防治EBS复发，取得了良好效果。
R. Sangermano等[24]使用Lf来治疗EBS，取得了令人满意的效果。EBS患儿在清除口腔内的EBS后，每天服用2次Forhans Gengi-For?含片（含有50mg Lf和50mg维生素D）并且使用含Lf的牙膏（Forhans scudo naturale），对不能配合的幼儿，可以在进行口腔清洁后将含片磨碎加水混合涂抹在患儿的牙齿上，有效地防止EBS复发。在女性怀孕期间，激素会发生很大的变化，血清IL-6水平升高，对铁的需求增加导致铁在细胞和包括唾液在内的分泌物中积累。一名43岁患有EBS的孕妇通过使用Forhans Gengi-For?含片局部治疗6个月后加口服治疗30d，EBS逐渐减退。
摄入益生菌适量，有助于维持有利的微生物共生环境，恢复口腔微生物群的动态平衡[40]。有体外研究证实唾液链球菌对BPB有抑制作用[41]，一项随机对照研究评估了口服益生菌唾液链球菌M18对EBS儿童的疗效，结果发现在色素清洁后服用益生菌3个月，可以减少EBS的复发率[42]。
3 小结
EBS是一种外源性色素沉着的类型，也是一种特殊的菌斑。其病因与细菌、饮食和唾液有关，近年来关于EBS和铁代谢的研究日益增多，铁对其相關微生物群落的作用机制尚不清楚。除了使用常规的机械清除色素的治疗方法外，还可以结合化学、光疗以及微生物疗法治疗和减少EBS的复发。
[参考文献]
[1]Zyla T，Kawala B，Antoszewska-Smith J，et al.Black stain and dental caries： a review of the literature[J].Biomed Res Int，2015，2015：469392.
[2]Li Y，Zhang Q，Zhang F，et al.Analysis of the microbiota of black stain in the primary dentition[J].PLoS One，2015，10（9）：e137030.
[3]Zaja I，Aleric I，Prskalo K，et al.Risk factors associated with black tooth stain[J].Acta Clinica Croatica，2017，56（1）：28-35.
[4]Hervochon R，Lisan Q，Rubin F.Recurrent black stains of the tongue and the teeth[J]. Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis，2019，136（1）：53-54.
[5]Reid JS，Beeley JA，Macdonald DG.Investigations into black extrinsic tooth stain[J].J Dent Res，1977，56（8）：895-900.
[6]Zhang F，Li Y，Xun Z，et al.A preliminary study on the relationship between iron and black extrinsic tooth stain in children[J].Lett Appl Microbilo， 2017，64（6）：424-429.
[7]汪珍珍.龋病人群唾液菌群结构多样性及其与pH、铁的相关性研究[D].兰州：兰州大学，2016.
[8]Chen L，Zhang Q，Wang Y，et al.Comparing dental plaque microbiome diversity of extrinsic black stain in the primary dentition using Illumina MiSeq sequencing technique[J].BMC Oral Health，2019，19（1）：269. [9]Saba C，Solidani M，Berlutti F，et al.Black stains in the mixed dentition： a PCR microbiological study of the etiopathogenic bacteria[J].J Clin Pediatr Dent， 2006，30（3）：219-224.
[10]Natoli V.Black stain in adult： a case report[J].Saudi J Oral Dent Re，2019， 10（3）：557-560.
[11]Soro V，Dutton LC，Sprague SV，et al. Axenic culture of a candidate division TM7 bacterium from the human oral cavity and biofilm interactions with other oral bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（20）：6480-6489.
[12]张明珠，税艳青，吕罕鲜，等.成人牙面色素沉积与口腔产黑菌关系的研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22（11）：650-652.
[13]李霞，葛颂.铁/亚铁血红素对牙龈卟啉单胞菌生长及毒性的影响[J].口腔生物医学， 2015，30（1）：31-33.
[14]Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Mechanism of methaemo-globin breakdown by the lysine-specific gingipain of the periodontal pathogen porphyromonas gingivali[J].Biol Chem，2008，389（9）：1235-1238.
[15]Li YH，Zou C，Fu Y，et al.Oral microbial community typing of caries and pigment in primary dentition[J].BMC Genomics，2016，17（1）：558.
[16]张丽菊.454焦磷酸测序对乳牙龋及牙面色素沉着伴龋龈上菌斑及唾液微生物菌群研究[D]. 昆明：昆明医科大学，2015.
[17]Noorkhakim A，Rizal MF，Sutadi H.Differences in calcium and phosphate levels in the saliva of children with and without black dental stain[J].J Dent Res， 2018，11（1）：187-190.
[18]Claudia S，Ortiz-López，Veronica，et al. Risk factors for the presence of dental black plaque[J].Sci Rep-UK，2018，8（1）：2-6.
[19]覃兰茜.唾液分泌与饮食喜好相关性研究[D].杭州：浙江工商大學，2019.
[20]吴海燕，袁嘉璐，葛文娟，等.学龄前儿童乳牙色素沉着与乳牙龋关系研究[J].实用口腔医学杂志，2018，34（2）：253-256.
[21]Chen X，Zhan J，Lu H，et al.Factors associated with black tooth stain in Chinese preschool children[J].Clin Oral Invest，2014，18（9）：2059-2066.
[22]Martin JMG，Garcia MG，Leston JS，et al.Prevalence of black stain and associated risk factors in preschool Spanish children[J].Pediatr Int， 2013，55（3）：355-359.
[23]Imaneh A，Samaneh S，Mohsen SS.Effects of iron products on decay， tooth microhardness， and dental discoloration：a systematic review[J].Arch Pharma Pract，2020，11（1）：60-82.
[24]Sangermano R，Pernarella S，Straker M，et al.The treatment of black stain associated with of iron metabolism disorders with lactoferrin： a litterature search and two case studies[J].La Clinica terapeutica，2019，170（5）：373-381.
[25]Mesonjesi I.Are extrinsic black stains of teeth iron-saturated bovine lactoferrin and a sign of iron deficient anemia or iron overload？[J].Med Hypotheses，2012，79（2）：219-221.
[26]Nuraeni A，Budiardjo SB，Fauziah E.Ferum and magnesium levels in the Plaque and Saliva of children with dental black stain who consume UHT milk[J].J Int Dent Med Res，2018，11（3）：994-996. [27]Zhou J，Jiang N，Wang Z，et al.Influences of pH and iron concentration on the salivary microbiome in individual humans with and without caries[J].Appl Environ Microb，2017，83（4）：e02412-02416.
[28]Lee RJ，Bayne A，Tiangco M，et al.Prevention of tea-induced extrinsic tooth stain[J].Int J Dent Hyg，2014，12（4）：267-272.
[29]王左敏.口腔微生态失衡与全身健康的关系[J].中华口腔医学杂志，2019，54（3）：145-150.
[30]Mogens K.The oral microbiome-friend or foe[J].Eur J Oral Sci，2018，126 （Suppl.l）：5-12.
[31]张丰婧.三种牙面色素清除方法的效果比较[D].上海：上海交通大学，2016.
[32]何家欢.离体牙不同抛光方法扫描电镜观察及吸烟患者洁治后临床效果观察[D].石家庄：河北医科大学，2017.
[33]Patil SS，Rakhewar PS，Limaye PS，et al.A comparative evaluation of plaque-removing efficacy of air polishing and rubber-cup， bristle brush with paste polishing on oral hygiene status： A clinical study[J].J Int Soci Prev Com Dent， 2015，5（6）：457-462.
[34]邵彦雄，薛姣姣，彭灿邦，等.生物酶牙膏去除牙面外源性色素的临床疗效观察[J].临床口腔医学杂志，2018，34（1）：33-35.
[35]Morimoto S，Nagase DY，Tedesco TK，et al.Effect of bleaching agents on black tooth stains caused by chromogenic bacteria： 10 years follow-up case report[J].RGO - Revista Gaúcha de Odontologia，2018，66（2）：187-193.
[36]胡晓莉，凌均棨.光动力抗菌疗法在口腔疾病治疗中的应用进展[J].临床口腔医学杂志，2020，36（9）：565-568.
[37]Pessoa L，Galv?o V，Damante C，et al.Removal of black stains from teeth by photodynamic therapy： clinical and microbiological analysis[J]. BMJ Case Rep， 2015，2015： bcr2015212276.
[38]Albelda-Bernardo MA，Jovani-Sancho MDM，Veses V，et al. Remediation of adult black dental stains by phototherapy[J].BDJ Open，2018，4（1）：17035.
[39]Lihala R，Jayaprakash D，Jayaram P，et al.Recurrent black stains and periodontal disease[J].Indian J Dent Res，2019，30（5）：763-766.
[40]Anusha RL，Umar D，Basheer B，et al.The magic of magic bugs in oral cavity： probiotics[J].J Adv Pharm Technol Res，2015，6（2）：43-47.
[41]Gobbi E，Francesco M，Piccinelli G，et al.In vitro inhibitory effect of two commercial probiotics on chromogenic actinomycetes[J].Eur Arch Pediatr Dentistry，2020，21（6）：673-677.
[42]Bardellini E，Amadori F，Gobbi E，et al.Does streptococcus salivarius strain m18 assumption make black stains disappear in children[J].Oral Hlth Prev Dent， 2020，18（1）：161-164.
[收稿日期]2020-09-03
本文引用格式：丁慧，張石楠，刘娟，等.外源性牙面黑色素沉着的病因和治疗研究进展[J].中国美容医学，2021，30（8）：186-189.
[关键词]外源性牙面黑色素沉着;细菌;铁;饮食;唾液
[中图分类号]R781.4+6 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2021）08-0186-04
Etiology and Treatment Research Progress on Extrinsic Black Tooth Stain
DING Hui1， ZHANG Shi-nan2， LIU Juan1， ZHOU Ni1
（1.Department of Pediatric Dentistry;2.Department of Preventive Dentistry， Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650106， Yunnan， China）
Abstract： Extrinsic black stain （EBS） is characterized by discrete dark dots or lines on the tooth surface， which is a special plaque. It is easy to relapse after mechanical removal. Its etiology is related to bacteria， host and diet. Recently， increasing numbers of investigations which focus on the interaction between EBS and iron metabolism have been carried out. Studies have suggested that EBS could relate to dysbacteriosis. Currently， the main pathogenic bacteria reported were black-pigmented anarobic bod and actinomycetes. The saliva of EBS patients has high calcium concentration and strong buffer capacity， and eating foods rich in pigment and iron can promote EBS production. Sandblasting treatment is one of the mechanical cleaning methods that causes less damage to tooth structure. In addition， chemotherapy， phototherapy， lactoferrin， and probiotic microbial therapy can be used comprehensively to prevent the recurrence of EBS.
Key words： extrinsic black tooth stain; bacteria; iron; diet; salivary; treatment
外源性牙面黑色素沉著[1]（Extrinsic black tooth stain，EBS）指的是沉积在牙齿上平齐龈缘的不连续的黑点或黑褐色条带，很少延伸至牙冠的颈三分之一以上，也可存在于牙面的窝沟点隙中。不同于其他类型的色素，EBS是一种特殊牙菌斑，与其他牙菌斑相比，EBS菌群简单，微生物多样性减少，并含有微量的钙、镁、铁、铜和锌，容易钙化[2-3]。因EBS可牢固地黏附在牙齿上，日常的口腔护理（如：牙刷和牙膏的使用）很难将其完全清除，在口腔卫生良好的情况下也容易产生EBS，且清除后很容易复发，极大地影响了美观和口腔清洁[4]。EBS的病因机制尚未完全清楚，本文围绕细菌、宿主和饮食三个方面对EBS的病因展开讨论，介绍EBS治疗的新进展，为今后预防和治疗EBS提供参考。
1 EBS的病因
早期文献表明[5]，EBS是一种黑色不溶性铁化合物，由细菌产生的硫化氢与铁相互作用形成。Zhang等[6]通过电感耦合等离子体质谱法证实了EBS中铁的存在。同时基于16S rRNA扩增子测序结果预测EBS微生物群落功能，在测试的253条基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of gene and genomes，KEGG）途径中，EBS和非EBS患者的牙菌斑之间有56条KEGG途径不同，其中某些途径可能与铁代谢有关。对于绝大多数微生物来说， 铁元素是其生长所必须的一种重要元素。它作为辅因子在生化代谢反应、电子传递等生命活动过程中发挥着极其重要的作用[7]。Zhang等[6]在分析EBS与铁和微生物之间的关系时，提出了两个假说。第一，EBS是微生物代谢的结果，微生物代谢产生铁化合物形成了EBS;第二，环境因素（例如饮食）通过化学反应产生EBS，同时改变EBS中的微生物群落。牙齿上的沉积物能为细菌提供营养物质，细菌的代谢产物也会参与EBS的形成。 1.1 细菌：革兰氏阳性杆菌，特别是衣氏放线菌和内氏放线菌是EBS的主要可培养微生物[8]。Saba等[9]研究发现，口腔内有放线菌属的人患EBS的风险比没有的人高四倍。当唾液或牙龈液中铁浓度大于10?mol/L时，细菌繁殖速度加快，放线菌代谢产生的硫化氢和铁生成不溶性的硫化铁[10]。另外，一些研究也发现[8] Candidate_division_TM7菌属含量低于非EBS组（P<0.05），Candidate_division_TM7能调控口腔生物膜的形成，还可以与其他微生物间相互作用影响口腔微生物群落组成[11]，但Candidate_division_TM7菌属对EBS的影响机制仍不清楚。
张明珠等[12]通过采集牙菌斑样本研究产黑色素类厌氧杆菌（Black- Pigmented Anarobic Bod， BPB）与EBS的关系，结果发现EBS患者的牙菌斑样本中包括牙龈卟啉菌 （Porphyromonas gingivalis， P.g）、牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodontalis，P.e）和中间普氏菌 （Prevotella intermedicus， P.i）检出率明显高于非EBS患者（P<0.05）。铁是P.g的重要生长因子，P.g通过调节铁吸收机制以及细胞内铁结合蛋白的活性来储存铁。多余的铁被储存在细胞表面，会使菌落呈特征性黑色。亚铁血红素μ-oxo二聚体在菌体表面的沉积是P.g黑色素的主要来源[13]。Smalley等[14]研究发现P.g精氨酸特异牙龈蛋白酶-R与氧化血红蛋白结合可以形成高铁血红蛋白，促进血红素沉积。高铁血红蛋白被赖氨酸特异牙龈蛋白酶K降解后导致原卟啉铁的释放，促进黑色素形成。P.i和P.n在低pH值环境中可形成并降解高铁血红蛋白产生卟啉铁，低pH值又可导致不溶性卟啉铁的沉积，从而促进色素沉积。
Li等[15]应用基于Dirichlet多项式混合的聚类分析方法来研究EBS患者口腔微生物菌落类型，发现纤毛菌属和梭杆菌属与EBS形成相关。张丽菊[16]采用454焦磷酸测序技术对EBS组和非EBS组乳牙龈上菌斑和非刺激性唾液微生物进行全面分析，发现了EBS组唾液微生物门水平覆盖少于非EBS组。菌斑和唾液组间与健康人群相比较均有优势菌群，与EBS相关的菌斑优势菌群有链球菌属，罗氏菌属，马赛菌属和寡养单胞菌属等10个菌属。唾液优势菌群有韦荣球菌属，卟啉菌属，梭杆菌属和二氧化碳噬纤维菌属等13个优势菌属，表明生态失调可能是EBS的一个病因。
1.2 宿主：Ariq Noorkhakim等[17]研究发现EBS儿童唾液中钙、磷含量明显高于非EBS儿童，高浓度的钙和磷能增加唾液缓冲能力，对不耐酸的放线菌属生长有促进作用，进而影响菌斑的细菌组成，这可能解释了EBS患者放线菌的优势。关于EBS和唾液pH值之间的关系，现在的研究结果不一致。Katica Prskalo等[3]研究发现EBS患者唾液pH值低于非EBS患者。在酸性条件下，表面牙齿容易脱矿，对铁的吸收会增加。然而Claudia等[18]通过检测EBS组和非EBS组的非刺激性唾液，发现EBS组pH的平均值高于对照组（8.0±0.5 vs.7.2±0.7）。较高的pH值会降低铁的溶解度，同时减少细菌对铁的利用率[7]。唾液的理化性质会随着年龄、情绪、疾病、口腔环境和饮食习惯等的变化而变化[19]，在一定程度上，唾液也可以反映身体的健康状态。关于唾液和EBS之间的关系还有待进一步研究。
1.3 食物：据报道，食用富含色素[20]的饮料、蔬菜和中草药，进食酸性食物[21]，以及饮用高pH值及含铁量高的水[18]会增加患EBS的风险。多酚是某些蔬菜和饮料，如：茶和咖啡的组分，对非血红素铁的吸收具有明显的抑制作用，可以在富脯蛋白的介导下与金属阳离子发生反应，产生色素[16]。Garcia Martin[22] 等人的横断面研究发现EBS与母亲妊娠期的补铁量及婴儿期的铁摄入量有关，不同成分和浓度的铁补充剂导致EBS的程度不同[23]。经常食用富含铁的食物如蔬菜、豆类、乳制品、鸡蛋会促进BPB的发展，增加EBS的患病率[1]。有流行病学调查显示肺炎和EBS的患病率有关[21]，原因可能是抗生素的频繁使用影响了口腔的菌群平衡，致使BPB增加，导致色素沉积[1]。
唾液中的乳铁蛋白（Lactoferrin， Lf）有很强的结合铁的能力，与细菌竞争Fe3+，抑制细菌生长繁殖[24]。Mesonjesi[25]在临床上发现，EBS患者每天除了饮用牛奶外，还食用大量奶酪，牛奶中含有大量的牛乳铁蛋白，能结合唾液中的铁，他推测EBS可能是铁饱和的牛乳铁蛋白，铁代谢紊乱可能会导致EBS，EBS可能是缺铁性贫血或铁过载的征兆。Ameliana Nuraeni等[26]通过检测定期喝牛奶的EBS儿童唾液中铁元素的含量，发现EBS儿童唾液中铁的浓度较非EBS儿童高，铁可以为口腔细菌提供必需的营养，铁的浓度也可以调节口腔唾液微生物群落的组成[27]。牛奶的铁含量为4%～25%，经常喝牛奶会导致铁沉积在牙齿上，建议喝完牛奶后立即漱口，避免产生EBS。牛奶中含有钙盐和磷盐，体内的亚铁与其结合会形成不溶性化合物，影响铁的吸收利用，所以缺铁性贫血的患者不宜饮用牛奶。Lee等[28]研究發现在茶水中添加牛奶有助于预防牙齿着色，牛奶中80%的蛋白质是酪蛋白，可以结合茶多酚，降低茶叶对牙齿着色能力。牛奶和EBS之间的相关性以及如何更好地发挥牛奶在口腔卫生保健中的作用都值得再思考。
口腔微生态是一个极其复杂的生态系统，由多个不同的微环境组成，不同的微环境之间会相互影响，微生物在口腔中通过复杂的聚集、竞争、拮抗及协同等相互作用维持口腔生态系的动态平衡。当微生态失衡，唾液的参数、饮食习惯和口腔卫生习惯发生改变，口腔内的稳态被破坏[29-30]，就可能会产生EBS。 2 EBS的治疗
根据EBS的形成机制和病因，目前治疗EBS的方法可以分为以下几类。
2.1 机械清除：有研究比较了超声洁治、喷砂洁治和矽粒子抛光去除牙面色素的效果，结果发现超声洁治组与气流喷砂组去除色素较为彻底，而矽粒子抛光组的牙面残留明显色素[31]。喷砂治疗使用喷砂机或装有喷砂装置的洁牙机通过特制手柄将混合高压和混合气的喷砂粉喷向牙面，能更好地清除牙齿死角处的色素，术者疲劳感小，耗时更少，洁治效率更高，对牙齿损伤更小[32-33]。
2.2 化学抑制：有研究发现从蛋壳中分离提取出的溶菌酶具有抗菌作用，抑制牙菌斑的形成。蛋白水解酶可水解唾液获得性膜及牙菌斑上的蛋白成分，从而有效去除结合在上面的色素。将它们制成含有生物酶的牙膏，可以用来减少牙面外源性色素[34]。有一项10年随访的病例报道显示，使用过氧化脲和过氧化氢对EBS进行漂白能减少复发[35]，过氧化物不仅有细胞毒性，还能抑制某些微生物的生长和代谢，特别是厌氧微生物，从而清除和抑制EBS的产生，保持口腔清洁和美观。
2.3 光动力疗法：光动力疗法（Photodynamic therapy， PDT）是利用低能量激光激活光敏剂产生的光动力效应对疾病进行诊断和治疗的一种新技术[36]。Larissa等[37]采用PDT对一名10岁的全口牙都有EBS男孩进行治疗，治疗后BPB水平显著降低，EBS消失，随访7个月无复发。将PDT用于控制细菌、病毒、真菌所致感染的化学疗法被称为光动力抗菌疗法（Antimicrobial photodynamic therapy， aPT）。Albelda等[38]通过记录EBS患者经过aPT治疗后，EBS的优势细菌的含量有所下降。治疗没有改变EBS的复发时间，但减少了EBS复发的面积和颜色。
2.4 微生物疗法：虽然EBS可以通过机械方法清除，但口腔内的微环境没有改变，EBS清除后容易复发[39]，有研究采用微生物疗法防治EBS复发，取得了良好效果。
R. Sangermano等[24]使用Lf来治疗EBS，取得了令人满意的效果。EBS患儿在清除口腔内的EBS后，每天服用2次Forhans Gengi-For?含片（含有50mg Lf和50mg维生素D）并且使用含Lf的牙膏（Forhans scudo naturale），对不能配合的幼儿，可以在进行口腔清洁后将含片磨碎加水混合涂抹在患儿的牙齿上，有效地防止EBS复发。在女性怀孕期间，激素会发生很大的变化，血清IL-6水平升高，对铁的需求增加导致铁在细胞和包括唾液在内的分泌物中积累。一名43岁患有EBS的孕妇通过使用Forhans Gengi-For?含片局部治疗6个月后加口服治疗30d，EBS逐渐减退。
摄入益生菌适量，有助于维持有利的微生物共生环境，恢复口腔微生物群的动态平衡[40]。有体外研究证实唾液链球菌对BPB有抑制作用[41]，一项随机对照研究评估了口服益生菌唾液链球菌M18对EBS儿童的疗效，结果发现在色素清洁后服用益生菌3个月，可以减少EBS的复发率[42]。
3 小结
EBS是一种外源性色素沉着的类型，也是一种特殊的菌斑。其病因与细菌、饮食和唾液有关，近年来关于EBS和铁代谢的研究日益增多，铁对其相關微生物群落的作用机制尚不清楚。除了使用常规的机械清除色素的治疗方法外，还可以结合化学、光疗以及微生物疗法治疗和减少EBS的复发。
[参考文献]
[1]Zyla T，Kawala B，Antoszewska-Smith J，et al.Black stain and dental caries： a review of the literature[J].Biomed Res Int，2015，2015：469392.
[2]Li Y，Zhang Q，Zhang F，et al.Analysis of the microbiota of black stain in the primary dentition[J].PLoS One，2015，10（9）：e137030.
[3]Zaja I，Aleric I，Prskalo K，et al.Risk factors associated with black tooth stain[J].Acta Clinica Croatica，2017，56（1）：28-35.
[4]Hervochon R，Lisan Q，Rubin F.Recurrent black stains of the tongue and the teeth[J]. Eur Ann Otorhinolaryngol Head Neck Dis，2019，136（1）：53-54.
[5]Reid JS，Beeley JA，Macdonald DG.Investigations into black extrinsic tooth stain[J].J Dent Res，1977，56（8）：895-900.
[6]Zhang F，Li Y，Xun Z，et al.A preliminary study on the relationship between iron and black extrinsic tooth stain in children[J].Lett Appl Microbilo， 2017，64（6）：424-429.
[7]汪珍珍.龋病人群唾液菌群结构多样性及其与pH、铁的相关性研究[D].兰州：兰州大学，2016.
[8]Chen L，Zhang Q，Wang Y，et al.Comparing dental plaque microbiome diversity of extrinsic black stain in the primary dentition using Illumina MiSeq sequencing technique[J].BMC Oral Health，2019，19（1）：269. [9]Saba C，Solidani M，Berlutti F，et al.Black stains in the mixed dentition： a PCR microbiological study of the etiopathogenic bacteria[J].J Clin Pediatr Dent， 2006，30（3）：219-224.
[10]Natoli V.Black stain in adult： a case report[J].Saudi J Oral Dent Re，2019， 10（3）：557-560.
[11]Soro V，Dutton LC，Sprague SV，et al. Axenic culture of a candidate division TM7 bacterium from the human oral cavity and biofilm interactions with other oral bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2014，80（20）：6480-6489.
[12]张明珠，税艳青，吕罕鲜，等.成人牙面色素沉积与口腔产黑菌关系的研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志，2012，22（11）：650-652.
[13]李霞，葛颂.铁/亚铁血红素对牙龈卟啉单胞菌生长及毒性的影响[J].口腔生物医学， 2015，30（1）：31-33.
[14]Smalley JW，Birss AJ，Szmigielski B，et al.Mechanism of methaemo-globin breakdown by the lysine-specific gingipain of the periodontal pathogen porphyromonas gingivali[J].Biol Chem，2008，389（9）：1235-1238.
[15]Li YH，Zou C，Fu Y，et al.Oral microbial community typing of caries and pigment in primary dentition[J].BMC Genomics，2016，17（1）：558.
[16]张丽菊.454焦磷酸测序对乳牙龋及牙面色素沉着伴龋龈上菌斑及唾液微生物菌群研究[D]. 昆明：昆明医科大学，2015.
[17]Noorkhakim A，Rizal MF，Sutadi H.Differences in calcium and phosphate levels in the saliva of children with and without black dental stain[J].J Dent Res， 2018，11（1）：187-190.
[18]Claudia S，Ortiz-López，Veronica，et al. Risk factors for the presence of dental black plaque[J].Sci Rep-UK，2018，8（1）：2-6.
[19]覃兰茜.唾液分泌与饮食喜好相关性研究[D].杭州：浙江工商大學，2019.
[20]吴海燕，袁嘉璐，葛文娟，等.学龄前儿童乳牙色素沉着与乳牙龋关系研究[J].实用口腔医学杂志，2018，34（2）：253-256.
[21]Chen X，Zhan J，Lu H，et al.Factors associated with black tooth stain in Chinese preschool children[J].Clin Oral Invest，2014，18（9）：2059-2066.
[22]Martin JMG，Garcia MG，Leston JS，et al.Prevalence of black stain and associated risk factors in preschool Spanish children[J].Pediatr Int， 2013，55（3）：355-359.
[23]Imaneh A，Samaneh S，Mohsen SS.Effects of iron products on decay， tooth microhardness， and dental discoloration：a systematic review[J].Arch Pharma Pract，2020，11（1）：60-82.
[24]Sangermano R，Pernarella S，Straker M，et al.The treatment of black stain associated with of iron metabolism disorders with lactoferrin： a litterature search and two case studies[J].La Clinica terapeutica，2019，170（5）：373-381.
[25]Mesonjesi I.Are extrinsic black stains of teeth iron-saturated bovine lactoferrin and a sign of iron deficient anemia or iron overload？[J].Med Hypotheses，2012，79（2）：219-221.
[26]Nuraeni A，Budiardjo SB，Fauziah E.Ferum and magnesium levels in the Plaque and Saliva of children with dental black stain who consume UHT milk[J].J Int Dent Med Res，2018，11（3）：994-996. [27]Zhou J，Jiang N，Wang Z，et al.Influences of pH and iron concentration on the salivary microbiome in individual humans with and without caries[J].Appl Environ Microb，2017，83（4）：e02412-02416.
[28]Lee RJ，Bayne A，Tiangco M，et al.Prevention of tea-induced extrinsic tooth stain[J].Int J Dent Hyg，2014，12（4）：267-272.
[29]王左敏.口腔微生态失衡与全身健康的关系[J].中华口腔医学杂志，2019，54（3）：145-150.
[30]Mogens K.The oral microbiome-friend or foe[J].Eur J Oral Sci，2018，126 （Suppl.l）：5-12.
[31]张丰婧.三种牙面色素清除方法的效果比较[D].上海：上海交通大学，2016.
[32]何家欢.离体牙不同抛光方法扫描电镜观察及吸烟患者洁治后临床效果观察[D].石家庄：河北医科大学，2017.
[33]Patil SS，Rakhewar PS，Limaye PS，et al.A comparative evaluation of plaque-removing efficacy of air polishing and rubber-cup， bristle brush with paste polishing on oral hygiene status： A clinical study[J].J Int Soci Prev Com Dent， 2015，5（6）：457-462.
[34]邵彦雄，薛姣姣，彭灿邦，等.生物酶牙膏去除牙面外源性色素的临床疗效观察[J].临床口腔医学杂志，2018，34（1）：33-35.
[35]Morimoto S，Nagase DY，Tedesco TK，et al.Effect of bleaching agents on black tooth stains caused by chromogenic bacteria： 10 years follow-up case report[J].RGO - Revista Gaúcha de Odontologia，2018，66（2）：187-193.
[36]胡晓莉，凌均棨.光动力抗菌疗法在口腔疾病治疗中的应用进展[J].临床口腔医学杂志，2020，36（9）：565-568.
[37]Pessoa L，Galv?o V，Damante C，et al.Removal of black stains from teeth by photodynamic therapy： clinical and microbiological analysis[J]. BMJ Case Rep， 2015，2015： bcr2015212276.
[38]Albelda-Bernardo MA，Jovani-Sancho MDM，Veses V，et al. Remediation of adult black dental stains by phototherapy[J].BDJ Open，2018，4（1）：17035.
[39]Lihala R，Jayaprakash D，Jayaram P，et al.Recurrent black stains and periodontal disease[J].Indian J Dent Res，2019，30（5）：763-766.
[40]Anusha RL，Umar D，Basheer B，et al.The magic of magic bugs in oral cavity： probiotics[J].J Adv Pharm Technol Res，2015，6（2）：43-47.
[41]Gobbi E，Francesco M，Piccinelli G，et al.In vitro inhibitory effect of two commercial probiotics on chromogenic actinomycetes[J].Eur Arch Pediatr Dentistry，2020，21（6）：673-677.
[42]Bardellini E，Amadori F，Gobbi E，et al.Does streptococcus salivarius strain m18 assumption make black stains disappear in children[J].Oral Hlth Prev Dent， 2020，18（1）：161-164.
[收稿日期]2020-09-03
本文引用格式：丁慧，張石楠，刘娟，等.外源性牙面黑色素沉着的病因和治疗研究进展[J].中国美容医学，2021，30（8）：186-189.