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摘要：利用MDCC-MSB1细胞系从江苏省泰州市发病鸡中分离获得1株病毒，通过间接荧光抗体试验（IFA）确定该病毒为鸡传染性贫血病毒（CAV）。利用PCR扩增、电泳、克隆、核酸测序得到全长2 324 bp的基因编码区序列，该序列碱基完整，无缺失和插入。经遗传学方法分析发现，该株序列与GenBank中已收录的可见CAV序列同源性为96.5%～99.8%。CAV的3个编码基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度变异，以VP1变异程度最大。使用电子显微镜观察到病毒粒子与鸡传染性贫血病毒一致，证实该病毒为鸡传染性贫血病毒新亚型，将其命名为CAV MY1305-30株并提交至GanBank，编号为KF318725、KF318726。
关键词： 鸡；传染性贫血病毒；分离鉴定；基因序列；编码
中图分类号： S855.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0244-03
鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia，CIA）最早被称为贫血综合征、贫血-皮炎综合征、出血性贫血病、贫血因子病等，其病原于1979年被首次分离并确定，早期称其为鸡贫血因子（chicken anemia agent，CAA）、鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV），之后逐渐统一称作鸡贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）。CAV的核酸为环状单股负链DNA，在1995年第6次国际病毒分类大会上将其与猪圆环病毒（PCV）、长尾鹦鹉啄羽病病毒（PBFDV）一起归属于圆环病毒科（Circoviridae），该科病毒是已知最小的动植物病毒，因此很少有人能通过电子显微镜观察到CAV。从CAV感染的MDCC-MSB1（鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系）细胞培养液中纯化的病毒粒子，经负染后在电子显微镜下呈直径约为20 nm的球状。CAV对乙醚、三氯甲烷均有抵抗力；对酸（pH值为3）作用3 h后仍保持稳定；对56 ℃下 120 min、70 ℃下60 min、80 ℃下15 min的处理均有抵抗力。鸡传染性贫血病的特征性病理变化为骨髓黄化和胸腺萎缩。发病鸡骨髓中的红髓组织被脂肪组织替代，呈黄色；胸腺严重萎缩，其大小仅为正常鸡的1/10。鸡传染性贫血病广泛流行于世界各地，呈垂直和水平传播[1]。
1材料
1.1待检样品
1日龄雏鸡来自江苏省泰州市，用间接酶联免疫吸附（ELISA）检测其父母代种鸡群血清，CAV阳性率高达87%。
1.2试剂和细胞
exTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 DNA Marker、酚氯仿异戊醇、蛋白酶K均购于大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、三氯甲烷均购于天津市富宇精细化工有限公司；琼脂糖购于上海英俊生物技术有限公司；EB替代物购于北京普利莱基因技术有限公司；工程菌DH5α、单克隆抗MDCC-MSB1细胞、CAV毒株阳性对照均由笔者所在实验室保存与提供。细胞培养液配方为83% RPMI 1640、15%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞维持液配方为93% RPMI 1640、5%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞冻存液配方为基础培养液、30%～40%胎牛血清、10% DMSO。
2方法
2.1样品的采集与处理
于江苏省泰州市发生鸡传染性贫血病的某鸡场采集 10～50 日龄的病鸡或病死鸡，在生物安全实验室内对其进行剖检，采集雏鸡的肝、脾、胸腺等组织脏器，充分研磨后用灭菌生理盐水制成悬浊液，加入终浓度为1 000 U/mL的双抗，于37 ℃下感作60 min。将其反复冻融3次后进行超声波处理，将1 000 g离心4 min后取上清，于70 ℃水浴处理5 min，再经体积分数50%的三氯甲烷处理15 min，离心并取上清，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，置于-70 ℃保存待检。其中一份用于PCR的初步检测，另一份用于病毒的分离培养。
2.2回归试验
将分离毒株的第4代至第6代MSB1细胞培养物分别腹腔接种于1日龄SPF鸡0.2 mL/羽。于接种后14 d迫杀，测定HCT值，并进行病理剖检及病理组织学检查。
2.3MDCC-MSB1细胞培养分离
将含病毒样品接种MDCC-MSB1细胞，每2～3 d盲传1代，每日观察细胞病变（CPE），当70%～80%的细胞崩解或代谢停止时收毒[2]，并置于-20 ℃保存备用。
2.4免疫荧光染色试验
取分离毒株细胞培养物和T K5803分别接种MDCC-MSB1细胞（3.0×105个/mL），于48 h后收集细胞培养物，以1 000 r/min离心5 min，将细胞沉淀用PBS洗3次并涂于载玻片，干燥后用冷丙酮固定10 min。接种1日龄SPF鸡的组织切片，也按同样方法固定后作为待测抗原，进行间接免疫荧光染色，并用荧光显微镜观察。
2.5分离毒株的CAV抗原检测
将1株分离毒株的细胞培养物经超声波破碎后离心，除去细胞碎片，用PEG浓缩后负染，进行电子显微镜观察。
2.6样品的PCR初步检测
2.6.1引物设计 根据已发表的CAV Cux-1、TR20等毒株的基因组序列设计并合成检测引物，用于样品的PCR检测。扩增靶基因的理论长度为582 bp，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
2.6.2组织DNA的提取 采用蛋白酶K裂解法提取组织中的核酸，操作步骤如下：（1）取200 μL组织研磨液移至1.5 mL 的EP管中；（2）向EP管中依次加入300 μL PBS、5 μL 蛋白酶K、60 μL 10% SDS，于56 ℃水浴消化1 h后，至微波炉中高火处理1～2 min，使其透明澄清；（3）向各管加入等体积的酚氯仿异戊醇，以12 000 r/min离心10 min；（4）将上清液移至新的1.5 mL EP管中，重复步骤（3）；（5）取上清液并加入等体积三氯甲烷，以12 000 r/min离心10 min；（6）取上清液并加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc（3 mol/L），于室温下静置1 h后，以12 000 r/min离心 10 min；（7）弃上清并加入500 μL 70%乙醇，以12 000 r/min离心 15 min；（8）弃上清，干燥5 min后加入40 μL Elution Buffer使其溶解。 2.6.3PCR检测 以病毒DNA为模板，用引物CAV-R、CAV-F 扩增所需目的基因。按反应体系（表1）配制好后混匀并置于PCR扩增仪中，运行如下程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，结束后于4 ℃保存。
表1 PCR 25 μL反应体系
组分 加入体积（μL/支）10×Buffer 2.5DNTP（2.5 mmol/L） 2.0引物CAV-R（20.0 mmol/L） 1.0引物CAV-F（20.0 mmol/L） 1.0rTaq酶 0.5ddH2O 15.5DNA模板（1 μg/μL）2.0合计25.0
2.6.4PCR扩增电泳操作步骤如下：（1）称取1 g琼脂糖，与100 mL的1×TAE缓冲液配成1%琼脂糖溶液。（2）溶解后冷却5～10 min，加入14 μL EB替代物并混匀。（3）架好梳子，倒入琼脂糖溶液，静置30 min使其凝固，移去梳子。（4）将PCR扩增产物与Loading Buffer缓冲液按 5 ∶1 的比例混匀，并将混匀后的液体加至电泳槽小孔中。（5）重复步骤（4），加入其他剩余PCR扩增产物。（6）选用DL2000的Marker，加至电泳槽小孔中。（7）接通电源，红色为正极、黑色为负极，将电压调至180 V。（8）电泳条带至1/3位置时即可停止，电泳时间约为10～15 min。（9）使用凝胶成像系统进行拍摄并保存。
3结果与分析
3.1 病毒的分离鉴定
感染CAV的MDCC-MSB1传代细胞呈IFA阳性（图1）。分离株CAV经电子显微镜观察，与以往发现的CAV结构一致（图2）。分离株与CAV阳性对照的电泳条带处于同一点位（图3）。
3.2序列测定结果
CAV MY1305-30株基因编码区全长为2 324 bp，碱基完整，无缺失和插入。与国际基因库中可见CAV序列进行同源性、亲缘关系的比对分析，结果发现，其同源性为96.5%～998%。CAV的3个编码基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度变异，其中VP1的变异程度最大。
3.3核苷酸和氨基酸位点的改变
由VP1基因比对序列结果可知，MY1305-30属于A3亚分支。在683位核苷酸中该点为T，而JAPAN-ABO46590则为G（图4）。
3.4遗传进化关系分析
将CAV MY1305-30株基因与国际基因库中可见CAV序列进行遗传进化比对分析，绘制遗传进化树。CAV MY1305-30株VP1基因属于以Majority为代表的基因群，与
A3 JAPAN AB046590.亲缘关系最近；与C Australia AF227982.、C Australia EF683159.亲缘关系最远（图5）。
CAV MY1305-30株基因VP2序列与印度的A1 India AY583756 CAV-B亲缘关系最近，与澳大利亚的C Australia AF227982、C Australia EF683159亲缘关系最远（图6）。
4结论与讨论
基因序列分析对比表明，江苏分离株CAV MY1305-30与其他32株CAV病毒编码区的核苷酸基因同源性为96.5%～99.8%；与vp1.seq、B_JS-China_73.seq、A3 JAPAN AB046590.seq株相对比，VP1序列仅有1个碱基不同。单一比对VP1、VP2、VP3的生物开放阅读框架（ORF），CAV MY1305-30与其他32株CAV毒株的核苷酸同源性分别达95.7%、99.1%、98.7%以上，表明该分离株变异不大，且CAV病毒本身变异很小。
由进化树分析结果可见，CAV VP1所对比的32个毒株分为两大分支，各分支中均有亚洲、欧美的毒株存在，并无明显的地域区分性。CAV VP2所对比的32个毒株也没有明显的地域区分性，两大分支中各有亚洲、欧美的毒株存在。
参考文献：
[1]Yassir M，Eltahir，et al. Molecular epidemiology of chicken anemia virusin commercial farms in China[J]. Virology Journal，2011，8：145-152.
[2]刘婉思，高宏雷，秦立廷，等. 1株野鸭源鸡贫血病病毒的分离鉴定及其编码区基因序列分析[J]. 中国兽医学报，2013，33（5）：654-658，679.李波，陈雪梅，李铁缘，等. 2种不同抗旱性冰草叶片解剖结构的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：247-249.
关键词： 鸡；传染性贫血病毒；分离鉴定；基因序列；编码
中图分类号： S855.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0244-03
鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia，CIA）最早被称为贫血综合征、贫血-皮炎综合征、出血性贫血病、贫血因子病等，其病原于1979年被首次分离并确定，早期称其为鸡贫血因子（chicken anemia agent，CAA）、鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus，CIAV），之后逐渐统一称作鸡贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）。CAV的核酸为环状单股负链DNA，在1995年第6次国际病毒分类大会上将其与猪圆环病毒（PCV）、长尾鹦鹉啄羽病病毒（PBFDV）一起归属于圆环病毒科（Circoviridae），该科病毒是已知最小的动植物病毒，因此很少有人能通过电子显微镜观察到CAV。从CAV感染的MDCC-MSB1（鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系）细胞培养液中纯化的病毒粒子，经负染后在电子显微镜下呈直径约为20 nm的球状。CAV对乙醚、三氯甲烷均有抵抗力；对酸（pH值为3）作用3 h后仍保持稳定；对56 ℃下 120 min、70 ℃下60 min、80 ℃下15 min的处理均有抵抗力。鸡传染性贫血病的特征性病理变化为骨髓黄化和胸腺萎缩。发病鸡骨髓中的红髓组织被脂肪组织替代，呈黄色；胸腺严重萎缩，其大小仅为正常鸡的1/10。鸡传染性贫血病广泛流行于世界各地，呈垂直和水平传播[1]。
1材料
1.1待检样品
1日龄雏鸡来自江苏省泰州市，用间接酶联免疫吸附（ELISA）检测其父母代种鸡群血清，CAV阳性率高达87%。
1.2试剂和细胞
exTaq DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 DNA Marker、酚氯仿异戊醇、蛋白酶K均购于大连宝生物工程有限公司；无水乙醇、三氯甲烷均购于天津市富宇精细化工有限公司；琼脂糖购于上海英俊生物技术有限公司；EB替代物购于北京普利莱基因技术有限公司；工程菌DH5α、单克隆抗MDCC-MSB1细胞、CAV毒株阳性对照均由笔者所在实验室保存与提供。细胞培养液配方为83% RPMI 1640、15%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞维持液配方为93% RPMI 1640、5%胎牛血清、1%双抗、1%谷氨酰胺；细胞冻存液配方为基础培养液、30%～40%胎牛血清、10% DMSO。
2方法
2.1样品的采集与处理
于江苏省泰州市发生鸡传染性贫血病的某鸡场采集 10～50 日龄的病鸡或病死鸡，在生物安全实验室内对其进行剖检，采集雏鸡的肝、脾、胸腺等组织脏器，充分研磨后用灭菌生理盐水制成悬浊液，加入终浓度为1 000 U/mL的双抗，于37 ℃下感作60 min。将其反复冻融3次后进行超声波处理，将1 000 g离心4 min后取上清，于70 ℃水浴处理5 min，再经体积分数50%的三氯甲烷处理15 min，离心并取上清，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，置于-70 ℃保存待检。其中一份用于PCR的初步检测，另一份用于病毒的分离培养。
2.2回归试验
将分离毒株的第4代至第6代MSB1细胞培养物分别腹腔接种于1日龄SPF鸡0.2 mL/羽。于接种后14 d迫杀，测定HCT值，并进行病理剖检及病理组织学检查。
2.3MDCC-MSB1细胞培养分离
将含病毒样品接种MDCC-MSB1细胞，每2～3 d盲传1代，每日观察细胞病变（CPE），当70%～80%的细胞崩解或代谢停止时收毒[2]，并置于-20 ℃保存备用。
2.4免疫荧光染色试验
取分离毒株细胞培养物和T K5803分别接种MDCC-MSB1细胞（3.0×105个/mL），于48 h后收集细胞培养物，以1 000 r/min离心5 min，将细胞沉淀用PBS洗3次并涂于载玻片，干燥后用冷丙酮固定10 min。接种1日龄SPF鸡的组织切片，也按同样方法固定后作为待测抗原，进行间接免疫荧光染色，并用荧光显微镜观察。
2.5分离毒株的CAV抗原检测
将1株分离毒株的细胞培养物经超声波破碎后离心，除去细胞碎片，用PEG浓缩后负染，进行电子显微镜观察。
2.6样品的PCR初步检测
2.6.1引物设计 根据已发表的CAV Cux-1、TR20等毒株的基因组序列设计并合成检测引物，用于样品的PCR检测。扩增靶基因的理论长度为582 bp，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
2.6.2组织DNA的提取 采用蛋白酶K裂解法提取组织中的核酸，操作步骤如下：（1）取200 μL组织研磨液移至1.5 mL 的EP管中；（2）向EP管中依次加入300 μL PBS、5 μL 蛋白酶K、60 μL 10% SDS，于56 ℃水浴消化1 h后，至微波炉中高火处理1～2 min，使其透明澄清；（3）向各管加入等体积的酚氯仿异戊醇，以12 000 r/min离心10 min；（4）将上清液移至新的1.5 mL EP管中，重复步骤（3）；（5）取上清液并加入等体积三氯甲烷，以12 000 r/min离心10 min；（6）取上清液并加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc（3 mol/L），于室温下静置1 h后，以12 000 r/min离心 10 min；（7）弃上清并加入500 μL 70%乙醇，以12 000 r/min离心 15 min；（8）弃上清，干燥5 min后加入40 μL Elution Buffer使其溶解。 2.6.3PCR检测 以病毒DNA为模板，用引物CAV-R、CAV-F 扩增所需目的基因。按反应体系（表1）配制好后混匀并置于PCR扩增仪中，运行如下程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环35次；72 ℃延伸10 min，结束后于4 ℃保存。
表1 PCR 25 μL反应体系
组分 加入体积（μL/支）10×Buffer 2.5DNTP（2.5 mmol/L） 2.0引物CAV-R（20.0 mmol/L） 1.0引物CAV-F（20.0 mmol/L） 1.0rTaq酶 0.5ddH2O 15.5DNA模板（1 μg/μL）2.0合计25.0
2.6.4PCR扩增电泳操作步骤如下：（1）称取1 g琼脂糖，与100 mL的1×TAE缓冲液配成1%琼脂糖溶液。（2）溶解后冷却5～10 min，加入14 μL EB替代物并混匀。（3）架好梳子，倒入琼脂糖溶液，静置30 min使其凝固，移去梳子。（4）将PCR扩增产物与Loading Buffer缓冲液按 5 ∶1 的比例混匀，并将混匀后的液体加至电泳槽小孔中。（5）重复步骤（4），加入其他剩余PCR扩增产物。（6）选用DL2000的Marker，加至电泳槽小孔中。（7）接通电源，红色为正极、黑色为负极，将电压调至180 V。（8）电泳条带至1/3位置时即可停止，电泳时间约为10～15 min。（9）使用凝胶成像系统进行拍摄并保存。
3结果与分析
3.1 病毒的分离鉴定
感染CAV的MDCC-MSB1传代细胞呈IFA阳性（图1）。分离株CAV经电子显微镜观察，与以往发现的CAV结构一致（图2）。分离株与CAV阳性对照的电泳条带处于同一点位（图3）。
3.2序列测定结果
CAV MY1305-30株基因编码区全长为2 324 bp，碱基完整，无缺失和插入。与国际基因库中可见CAV序列进行同源性、亲缘关系的比对分析，结果发现，其同源性为96.5%～998%。CAV的3个编码基因序列VP1（1 315 bp）、VP2（643 bp）、VP3（366 bp）均有不同程度变异，其中VP1的变异程度最大。
3.3核苷酸和氨基酸位点的改变
由VP1基因比对序列结果可知，MY1305-30属于A3亚分支。在683位核苷酸中该点为T，而JAPAN-ABO46590则为G（图4）。
3.4遗传进化关系分析
将CAV MY1305-30株基因与国际基因库中可见CAV序列进行遗传进化比对分析，绘制遗传进化树。CAV MY1305-30株VP1基因属于以Majority为代表的基因群，与
A3 JAPAN AB046590.亲缘关系最近；与C Australia AF227982.、C Australia EF683159.亲缘关系最远（图5）。
CAV MY1305-30株基因VP2序列与印度的A1 India AY583756 CAV-B亲缘关系最近，与澳大利亚的C Australia AF227982、C Australia EF683159亲缘关系最远（图6）。
4结论与讨论
基因序列分析对比表明，江苏分离株CAV MY1305-30与其他32株CAV病毒编码区的核苷酸基因同源性为96.5%～99.8%；与vp1.seq、B_JS-China_73.seq、A3 JAPAN AB046590.seq株相对比，VP1序列仅有1个碱基不同。单一比对VP1、VP2、VP3的生物开放阅读框架（ORF），CAV MY1305-30与其他32株CAV毒株的核苷酸同源性分别达95.7%、99.1%、98.7%以上，表明该分离株变异不大，且CAV病毒本身变异很小。
由进化树分析结果可见，CAV VP1所对比的32个毒株分为两大分支，各分支中均有亚洲、欧美的毒株存在，并无明显的地域区分性。CAV VP2所对比的32个毒株也没有明显的地域区分性，两大分支中各有亚洲、欧美的毒株存在。
参考文献：
[1]Yassir M，Eltahir，et al. Molecular epidemiology of chicken anemia virusin commercial farms in China[J]. Virology Journal，2011，8：145-152.
[2]刘婉思，高宏雷，秦立廷，等. 1株野鸭源鸡贫血病病毒的分离鉴定及其编码区基因序列分析[J]. 中国兽医学报，2013，33（5）：654-658，679.李波，陈雪梅，李铁缘，等. 2种不同抗旱性冰草叶片解剖结构的比较[J]. 江苏农业科学，2015，43（9）：247-249.