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【摘要】目的：建立以绿原酸为内参物，测定降脂宁颗粒中君药山楂所含的3个有机酸类成分（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸）含量的一测多评（QAMS）方法。方法：采用ThermoUltimate3000液相色谱仪，以WatersX-bridgeC18色谱柱，流动相乙腈-1%磷酸溶液梯度洗脱，检测波长326nm，体积流量1.0mL/min，柱温30℃进行测定。以绿原酸作为内参物，建立制剂中其他2种指标性成分的相对校正因子，从而计算各待测成分的量，并与外标法的测定结果进行比较，对该方法进行可行性验证。结果：在各待测成分的线性范围内，降脂宁颗粒中的绿原酸与新绿原酸、隐绿原酸2种有效成分的校正因子重现性良好，分别为1.07、0.99;采用一测多评法测定有机酸类成分含量与外标法的含量测定结果无显著性差异。结论：以绿原酸为内参物，建立的一测多评结果准确可靠，可用于降脂宁颗粒多指标成分的质量控制。
【关键词】一测多评;降脂宁颗粒;相对校正因子;新绿原酸;绿原酸;隐绿原酸
【中图分类号】R284【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）8-0049-05
降脂宁颗粒最早收载于吉林省药品标准（1986年版），原名“血脂宁冲剂”。处方由山楂（去核）、制何首乌、决明子、荷叶4味药材组成，具有降血脂、软化血管的作用。从国家食品药品监督管理总局数据库中查询到，目前其执行标准共11份，尚未对方中君药山楂进行含量控制，而山楂质量的优劣直接影响降脂宁颗粒的药效。山楂的化学成分主要包括黄酮及黄酮苷类、有机酸类、黄烷类及其聚合物等，有机酸类是山楂健胃消食的有效成分[1-7]。研究选取山楂中的有机酸类成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸作为指标性成分进行含量测定。
复方中药制剂中药效的发挥是多组分共同作用的结果，其成分具有多样性、复杂性特点。因此，中药制剂较单味药材更需要强调其多成分、多靶点特征。为了更好的控制降脂宁颗粒中山楂的含量，实验采用多指标质量控制的“一测多评”方法首次对降脂宁颗粒山楂含量进行全面的控制，通过对一个对照品易得成分的测定，实现多个成分的同步监控，本文以绿原酸为内参物，采用高效液相色谱法测3个有机酸类成分含量，改善目前中检院尚无新绿原酸、隐绿原酸等对照品供应情况，尤其是完善了现行质量标准中无君药山楂含量控制问题[8-15]。
1仪器与材料
1.1仪器Ultimate3000液相色谱仪及配套工作站（PDA检测器，赛默飞世尔科技有限公司）;色谱柱：依利特ODS2C18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;AgilentZORBAXSBC18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;WatersX-bridgeC18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;百万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2材料新绿原酸（批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：93.37%）、绿原酸（批号：110753-201415，中国食品药品检定研究院，含量：96.2%）、隐绿原酸（批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.07%）;降脂宁颗粒（生产企业：A公司，批号：a-1，a-2，a-3，a-4，a-5，a-6，a-7，a-8，a-9，a-10）。色谱乙腈（美国TEDIA，LOT17080656）、甲醇（国药集团化学试剂有限公司，10014118），超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按下表1规定进行梯度洗脱;流速为1.0mL/min;新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326nm;理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于10000。图谱见图1。
2.2混合对照品溶液的制备称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1mL分别含35μg、45μg、34μg溶液，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量上述对照品储备液1mL，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液。
2.3供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入50%甲醇100mL，称定重量，超声（功率250w，频率100kHz）处理45min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性样品的制备取不含山楂药材的样品，按照降脂宁颗粒配方（删除山楂药材），模拟工艺制备阴性样品，照供试品溶液制备项下方法制得阴性样品溶液。
2.5方法考察
2.5.1线性关系考察精密吸取“2.2”项下对照品溶液，进样量分别为2、3、5、10、15μL分别注入液相色谱仪，以峰面积A对质量数μg进行线性回归计算，得到绿原酸的线性回归方程为：y=32060x+69.71，r=0.9996，线性范围0.0090μg～0.0672μg;隐绿原酸线性回归方程为：y=2335x+94.32，r=0.9993，线性范围0.0066μg～0.03867μg;新绿原酸线性回归方程为：y=3455x+45.28，r=0.9991，线性范围0.0077～0.0525μg;结果表明3种成分线性范围内关系良好。
2.5.2精密度试验精密量取“2.2”项下对照品溶液的制备项下的混合对照品溶液10μL，连续进样6次，记录色谱图，其RSD值分别为新绿原酸1.7%、绿原酸0.6%、隱绿原酸1.5%，表明仪器精密度良好。
2.5.3重复性试验取同一批（批号：a-1）的样品，按“2.1”项下含量测定方法，重复测定6次，记录色谱图，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别为1.6%、1.0%、2.4%，表明方法重复性良好。结果见表2。 2.5.4稳定性试验取同一批（批号：a-1）的样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0，24，48h进样，记录色谱图，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别0.8%、1.9%、1.7%，结果表明48h内供试品溶液是稳定的。
2.5.5准确度采用加样回收法，取已知含量的样品（批号：a-1平均含量：含新绿原酸0.0182mg/g、绿原酸0.5767mg/g、隐绿原酸0.0224mg/g）6份，每份1.5g，精密加入对照品溶液（含新绿原酸：0.02559mg/mL、绿原酸：0.1743mg/mL、隐绿原酸：0.01988mg/mL）1mL置具塞锥瓶中，挥干，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的回收率，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸平均加样回收率RSD分别为1.7%、1.1%、1.0%。表明本方法具有良好的回收率。结果见表3。
2.6相对校正因子（fsi）和相对保留时间（t）的确定
2.6.1校正因子的计算方法多标多测的研究思路起源于内标法、校正因子法、主成分自身对照法以及紫外百分吸收系数法等几个概念。计算公式：fsi=fi/fs=（As/Cs）/（Ai/Ci）=（As·Ci）/（Ai·Cs），式中As为内参物峰面积，Ai为其他组分峰面积，Cs内参物浓度，Ci为其他组分浓度。在方法学建立时，需要准备待测组分及所选内参物的对照品，求出内参物与个待测组分见的校正因子，并把它作为常数用于以后的含量测定计算中。含量测定过程中，只需准备内参物的对照品，因而内参物（s）浓度可按常规方法进行测定，应用校正因子，结合内参物实测值计算待测组分浓度（Ci）。
2.6.2待测成分fsi和t的计算取“2.2”项下的混合对照品溶液进样，测定峰面积，以绿原酸为参照，以其相应的峰为S1峰，计算各待测成分与绿原酸之间的fsi与t，结果相对保留时间及相对校正因子见下表4。
2.7fsi耐用性考察
2.7.1不同色谱柱对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统分别对三种品牌（依利特ODS2、AgilentZORBAXSB、watersX-bridge）的C18色谱柱分别进行测定，考察不同色谱柱对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表5。
2.7.2不同柱温柱对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，以柱温20、30、40℃分别进行测定，考察不同柱温对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表6。
2.7.3不同体积流量对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，分别考察了流速为0.8、1.0、1.2mL·min-1体积流量对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表7。
2.7.4不同人员对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，考察人员对fsi和t的影响，精密吸取三位不同人员所配制的混合对照品溶液（见表8），分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表9。
2.7.5不同仪器对fsi和t的影响精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10μL，分别采用Ultimate3000，waters2998不同厂牌高效液相色谱仪分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表10。
2.8一测多评法与外标法测定结果的比较取10批降脂宁颗粒样品按“2.3”项下制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标一点法对其进行定量计算，见表11。结果表明，常规的外标一点法测法实测量本实验所建立的一测多评计算所得量，结果差异不大，证明本实验所建立的方法具有较好的准确性和可行性，所得结果可靠。
3讨论
对于供试品制备方法的考察，实验从提取方法（超声和回流）、提取溶剂（20%甲醇，50%甲醇，80%甲醇，甲醇）以及提取时间（15min，30min，45min）对降脂宁颗粒的提取效果进行了比较，结果表明，采用50%甲醇超声提取45min，3种有效成分的量较高，且色谱峰的分离效果最佳。
山楂有机酸类成分主要有熊果酸、枸橼酸、绿原酸等，实验设计初期，希望统一色谱条件下测定熊果酸、枸橼酸、绿原酸三个有效成分，熊果酸极性与枸橼酸和绿原酸相差较大，在一个色谱条件下，无法实现三者的共同测定。另据文献报道[16]熊果酸不溶于水，而降脂宁颗粒中山楂工艺为用水煎煮，样品中枸橼酸峰达不到较好的分离效果，基于此考虑选取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对山楂进行评价。据报道[17]，绿原酸在酸性pH条件下十分稳定，在中性和碱性pH条件及加热情况下，绿原酸很容易水解并生成新绿原酸、隐绿原酸，因此采用一测多评测定三个成分的含量，以总量计评价降脂宁颗粒，更加合理。同时，通过中国食品药品检验研究院网站查询，中检院暂无新绿原酸、隐绿原酸对照品销售，故选择常见的绿原酸作为山楂有机酸检测的内参物，用以测定有机酸类中新绿原酸与隐绿原酸的含量。
本实验建立的绿原酸与其他2种有效成分的校正因子，并考察了不同规格色谱柱、柱温、体积流量、人员、仪器对校正因子和相对保留时间的影响，結果RSD均<5%，表明各成分的相对保留因子重复性好。实验中还采用外标外与一测多评法测定10批样品指标性成分含量进行比较，结果2种方法所测值无明显差异，说明该方法的建立基本达到节省对照品，以多指标控制药品质量的目的。
参考文献
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[15]刘慧妍，沈国滨.一测多评法同时测定野菊花中7种成分[J].中草药，2017，48（10）：2012-2013.
[16]黄秋妹，李宗.HPLC法测定山楂中熊果酸和齐墩果酸的含量[J].海峡药学，2007，19（3）：43-44.
[17]朱鹏，苗潇磊，陈勇.绿原酸、隐绿原酸和新綠原酸在中性和碱性pH条件下降解动力学[J].药学学报，2016，51（1）：122-126.
（收稿日期：2019-02-01编辑：程鹏飞）
【关键词】一测多评;降脂宁颗粒;相对校正因子;新绿原酸;绿原酸;隐绿原酸
【中图分类号】R284【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2019）8-0049-05
降脂宁颗粒最早收载于吉林省药品标准（1986年版），原名“血脂宁冲剂”。处方由山楂（去核）、制何首乌、决明子、荷叶4味药材组成，具有降血脂、软化血管的作用。从国家食品药品监督管理总局数据库中查询到，目前其执行标准共11份，尚未对方中君药山楂进行含量控制，而山楂质量的优劣直接影响降脂宁颗粒的药效。山楂的化学成分主要包括黄酮及黄酮苷类、有机酸类、黄烷类及其聚合物等，有机酸类是山楂健胃消食的有效成分[1-7]。研究选取山楂中的有机酸类成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸作为指标性成分进行含量测定。
复方中药制剂中药效的发挥是多组分共同作用的结果，其成分具有多样性、复杂性特点。因此，中药制剂较单味药材更需要强调其多成分、多靶点特征。为了更好的控制降脂宁颗粒中山楂的含量，实验采用多指标质量控制的“一测多评”方法首次对降脂宁颗粒山楂含量进行全面的控制，通过对一个对照品易得成分的测定，实现多个成分的同步监控，本文以绿原酸为内参物，采用高效液相色谱法测3个有机酸类成分含量，改善目前中检院尚无新绿原酸、隐绿原酸等对照品供应情况，尤其是完善了现行质量标准中无君药山楂含量控制问题[8-15]。
1仪器与材料
1.1仪器Ultimate3000液相色谱仪及配套工作站（PDA检测器，赛默飞世尔科技有限公司）;色谱柱：依利特ODS2C18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;AgilentZORBAXSBC18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;WatersX-bridgeC18，（4.6mm×250mm，5.0μm）;百万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2材料新绿原酸（批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：93.37%）、绿原酸（批号：110753-201415，中国食品药品检定研究院，含量：96.2%）、隐绿原酸（批号：MUST-15011413，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：99.07%）;降脂宁颗粒（生产企业：A公司，批号：a-1，a-2，a-3，a-4，a-5，a-6，a-7，a-8，a-9，a-10）。色谱乙腈（美国TEDIA，LOT17080656）、甲醇（国药集团化学试剂有限公司，10014118），超纯水。
2方法与结果
2.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按下表1规定进行梯度洗脱;流速为1.0mL/min;新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326nm;理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于10000。图谱见图1。
2.2混合对照品溶液的制备称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对照品适量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1mL分别含35μg、45μg、34μg溶液，摇匀，作为混合对照品储备液。精密量上述对照品储备液1mL，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液。
2.3供试品溶液的制备取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约3g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入50%甲醇100mL，称定重量，超声（功率250w，频率100kHz）处理45min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4阴性样品的制备取不含山楂药材的样品，按照降脂宁颗粒配方（删除山楂药材），模拟工艺制备阴性样品，照供试品溶液制备项下方法制得阴性样品溶液。
2.5方法考察
2.5.1线性关系考察精密吸取“2.2”项下对照品溶液，进样量分别为2、3、5、10、15μL分别注入液相色谱仪，以峰面积A对质量数μg进行线性回归计算，得到绿原酸的线性回归方程为：y=32060x+69.71，r=0.9996，线性范围0.0090μg～0.0672μg;隐绿原酸线性回归方程为：y=2335x+94.32，r=0.9993，线性范围0.0066μg～0.03867μg;新绿原酸线性回归方程为：y=3455x+45.28，r=0.9991，线性范围0.0077～0.0525μg;结果表明3种成分线性范围内关系良好。
2.5.2精密度试验精密量取“2.2”项下对照品溶液的制备项下的混合对照品溶液10μL，连续进样6次，记录色谱图，其RSD值分别为新绿原酸1.7%、绿原酸0.6%、隱绿原酸1.5%，表明仪器精密度良好。
2.5.3重复性试验取同一批（批号：a-1）的样品，按“2.1”项下含量测定方法，重复测定6次，记录色谱图，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别为1.6%、1.0%、2.4%，表明方法重复性良好。结果见表2。 2.5.4稳定性试验取同一批（批号：a-1）的样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0，24，48h进样，记录色谱图，测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量，其RSD值分别0.8%、1.9%、1.7%，结果表明48h内供试品溶液是稳定的。
2.5.5准确度采用加样回收法，取已知含量的样品（批号：a-1平均含量：含新绿原酸0.0182mg/g、绿原酸0.5767mg/g、隐绿原酸0.0224mg/g）6份，每份1.5g，精密加入对照品溶液（含新绿原酸：0.02559mg/mL、绿原酸：0.1743mg/mL、隐绿原酸：0.01988mg/mL）1mL置具塞锥瓶中，挥干，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以绿原酸为S峰，其余2个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸的回收率，结果新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸平均加样回收率RSD分别为1.7%、1.1%、1.0%。表明本方法具有良好的回收率。结果见表3。
2.6相对校正因子（fsi）和相对保留时间（t）的确定
2.6.1校正因子的计算方法多标多测的研究思路起源于内标法、校正因子法、主成分自身对照法以及紫外百分吸收系数法等几个概念。计算公式：fsi=fi/fs=（As/Cs）/（Ai/Ci）=（As·Ci）/（Ai·Cs），式中As为内参物峰面积，Ai为其他组分峰面积，Cs内参物浓度，Ci为其他组分浓度。在方法学建立时，需要准备待测组分及所选内参物的对照品，求出内参物与个待测组分见的校正因子，并把它作为常数用于以后的含量测定计算中。含量测定过程中，只需准备内参物的对照品，因而内参物（s）浓度可按常规方法进行测定，应用校正因子，结合内参物实测值计算待测组分浓度（Ci）。
2.6.2待测成分fsi和t的计算取“2.2”项下的混合对照品溶液进样，测定峰面积，以绿原酸为参照，以其相应的峰为S1峰，计算各待测成分与绿原酸之间的fsi与t，结果相对保留时间及相对校正因子见下表4。
2.7fsi耐用性考察
2.7.1不同色谱柱对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统分别对三种品牌（依利特ODS2、AgilentZORBAXSB、watersX-bridge）的C18色谱柱分别进行测定，考察不同色谱柱对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表5。
2.7.2不同柱温柱对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，以柱温20、30、40℃分别进行测定，考察不同柱温对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表6。
2.7.3不同体积流量对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，分别考察了流速为0.8、1.0、1.2mL·min-1体积流量对fsi和t的影响，记录色谱图，计算校正因子，RSD应小于5.0%，结果见表7。
2.7.4不同人员对fsi和t的影响采用高效液相色谱系统，考察人员对fsi和t的影响，精密吸取三位不同人员所配制的混合对照品溶液（见表8），分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表9。
2.7.5不同仪器对fsi和t的影响精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10μL，分别采用Ultimate3000，waters2998不同厂牌高效液相色谱仪分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD应小于5.0%，结果见表10。
2.8一测多评法与外标法测定结果的比较取10批降脂宁颗粒样品按“2.3”项下制备供试品溶液，分别采用一测多评法和外标一点法对其进行定量计算，见表11。结果表明，常规的外标一点法测法实测量本实验所建立的一测多评计算所得量，结果差异不大，证明本实验所建立的方法具有较好的准确性和可行性，所得结果可靠。
3讨论
对于供试品制备方法的考察，实验从提取方法（超声和回流）、提取溶剂（20%甲醇，50%甲醇，80%甲醇，甲醇）以及提取时间（15min，30min，45min）对降脂宁颗粒的提取效果进行了比较，结果表明，采用50%甲醇超声提取45min，3种有效成分的量较高，且色谱峰的分离效果最佳。
山楂有机酸类成分主要有熊果酸、枸橼酸、绿原酸等，实验设计初期，希望统一色谱条件下测定熊果酸、枸橼酸、绿原酸三个有效成分，熊果酸极性与枸橼酸和绿原酸相差较大，在一个色谱条件下，无法实现三者的共同测定。另据文献报道[16]熊果酸不溶于水，而降脂宁颗粒中山楂工艺为用水煎煮，样品中枸橼酸峰达不到较好的分离效果，基于此考虑选取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸对山楂进行评价。据报道[17]，绿原酸在酸性pH条件下十分稳定，在中性和碱性pH条件及加热情况下，绿原酸很容易水解并生成新绿原酸、隐绿原酸，因此采用一测多评测定三个成分的含量，以总量计评价降脂宁颗粒，更加合理。同时，通过中国食品药品检验研究院网站查询，中检院暂无新绿原酸、隐绿原酸对照品销售，故选择常见的绿原酸作为山楂有机酸检测的内参物，用以测定有机酸类中新绿原酸与隐绿原酸的含量。
本实验建立的绿原酸与其他2种有效成分的校正因子，并考察了不同规格色谱柱、柱温、体积流量、人员、仪器对校正因子和相对保留时间的影响，結果RSD均<5%，表明各成分的相对保留因子重复性好。实验中还采用外标外与一测多评法测定10批样品指标性成分含量进行比较，结果2种方法所测值无明显差异，说明该方法的建立基本达到节省对照品，以多指标控制药品质量的目的。
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（收稿日期：2019-02-01编辑：程鹏飞）