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[摘要] 目的 比较不同时期在常规体外受精（IVF）受精失败病例施行补救卵胞浆内单精子注射（ICSI）的受精情况以探讨补救ICSI的最佳时机。方法 将本院进行常规IVF失败的88例患者随机分为早期补救组与晚期补救组，早期补救组患者在常规IVF后4～8h实行补救ICSI，而晚期补救组在常规IVF后20～22h施行补救ICSI，比较两组患者正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率。 结果 早期补救组正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率分别为53.4%、93.8%、46.9%、38.5%、31.8%，晚期补救组则为46.1%、82.8%、32.1%、23.8%、6.8%，早期补救组上述指标均显著优于晚期补救组（P<0.05）。 结论 对于常规IVF失败后患者应早期施行补救ICSI进行再受精，能够显著改善常规IVF失败患者的结局。
[关键词] IVF；补救ICSI；受精率
[中图分类号] R711.6 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）17-25-03
由于卵母细胞及精子方面的原因，可以导致体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中的卵母细胞完全不受精或低受精等情况发生，文献报道，其发生率可达10%～25%[1]。近年来，卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术的发展，使得非男性因素导致上述IVF-ET失败患者有了再次受精的机会[2]。但对何时进行补救ICSI仍存在一定争议，本研究观察了早期补救ICSI与晚期补救ICSI的临床效果，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本院2010年2月～2013年2月收治88例非男性因素不孕患者，不孕因素主要包括输卵管、免疫、盆腔粘连、子宫内膜异位症等因素，上述患者进行常规IVF-ET失败并自愿进行补救ICSI，将88例患者随机分为早期补救组与晚期补救组，早期补救组44例，平均年龄（30.1±5.6）岁，不孕年限（5.7±4.1）年，晚期补救组44例，平均年龄（31.2±6.3）岁，
不孕年限（6.1±4.8）年。本研究经医学伦理委员会通过，并经患者签署知情同意书。早期补救组共44个周期，晚期补救组共44个周期，两组患者在女方年龄、不孕时间、平均每周期获卵数等方面无显著差异（P>0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 促排卵方案 在本生殖中心接受IVF患者采用常规方案促排卵，采用阴道超声检测卵泡发育情况，当超生检查发现卵巢存在2个以上直径18mm以上的卵泡或者3个直径在17mm以上的卵泡时，给予患者5000～10 000IU的HCG注射。34～36h后采用17G取卵针在阴道超声探头下取卵，取卵压力为110mm Hg。
1.2.2 精子准备 采用常规方法处理精子：用上游离心法进行离心后，最终受精液中精子的密度应达到（5～10）×109/mL。
1.2.3 补救ICSI 采用常规IVF后3h加入精子，在精卵结合后6h将卵周颗粒细胞清除。早期补救组在常规受精后4～6h进行观察，晚期补救组在常规受精后16～18h进行观察，若所有卵母细胞均未出现第二极体则判断为未受精，
若出现第二极体的卵母细胞占所有成熟卵母细胞20%以上时判断为低受精，征求上述患者意见是否同意进行补救ICSI。显微注射后选择发育正常的受精卵进行培养，培养至D2或D3期时挑选优质胚胎进行宫腔内移植，将其他胚胎进行冷冻保存。所有患者在采卵当天即开始进行黄体酮注射，植入宫腔14d后检测血β-HCG，若β-HCG>5.3IU/L则判断为生化妊娠，植入宫腔28d后采用超生检查孕囊及胎心搏动，若存在则判断为临床妊娠[3]。
1.3 评价标准
比较两组患者正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率等指标。受精率=受精卵数/补救ICSI卵数×100%，卵裂率=卵裂细胞数/受精卵数×100%，可移植胚胎率=可移植胚胎数/卵裂细胞数×100%，优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂细胞数×100%，妊娠率=妊娠例数/周期数×100%[4]。
1.4 统计学方法
采用SPSS14.0进行统计学分析，对正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率等计数资料采用x2检验，对周期数、女性年龄、不孕年限、平均获卵数等计量资料采用t检验，计量资料采用（）表示，检验水准设定为α=0.05，P<0.05时差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者一般情况的比较
两组患者的周期数、女性年龄、不孕年限、平均获卵数无显著差异（P>0.05）。具体见表1。
2.2 两组患者正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率的比较
早期补救组完全不受精16例，部分不受精28例，补救ICSI成熟卵数420个；晚期补救组完全不受精18例，部分不受精26例，补救ICSI成熟卵数440个。早期补救组正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率均显著高于晚期补救组（P<0.05）。具体见表2。
3 讨论
由于精子和卵子本身缺陷、精卵融合障碍、卵母细胞激活缺陷、不合适的激素环境、卵母细胞胞质胞核发育不同步、遗传物质异常等原因，导致卵母细胞及精子成熟、精子获能、精子透明带结合、精卵融合、卵细胞激活等受精过程任一环节异常，均可引起受精失败。文献报道，常规IVF受精率为60%～70%，而完全不受精或低受精率可达10%～20%[5]。
有学者建议采用补救ICSI的方法挽救受精失败的卵母细胞，从而避免取消周期。但由于补救ICSI受精率及临床妊娠率均较低，因此限制了其在国内生殖中心的广泛开展。邹廉[6]认为造成补救ICSI受精率、妊娠率、出生率较低的原因主要包括两个原因：（1）卵母细胞体外培养可造成卵子染色体异常，而其异常几率与体外培养时间成正相关，而卵子染色体异常可直接导致胚胎发育潜能异常；（2）补救ICSI受精成功的卵裂之后，从而造成与子宫内膜发育不同步，不利于胚胎着床[7]。根据实施补救ICSI时间不同，补救ICSI可分为早期补救ICSI与晚期补救ICSI。目前大多数生殖中心采用常规IVF不受精后18～22h进行晚期补救ICSI，其受精率可达20%～60%。尽管如此，晚期补救ICSI的卵裂率、优质胚胎率、妊娠率均较低。朱丽霞[8]报道，采用晚期补救ICSI正常受精率达到72.3%，但卵裂率、优质胚胎率、妊娠率仅为86.2%、21.3%、2.9%。本研究结果与其一致，晚期补救组正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率分别为46.1%、82.8%、32.1%、23.8%、6.8%。导致晚期补救ICSI妊娠率较低的主要原因为卵母细胞异常，优于卵母细胞未受精且在体外环境培养时间较长，导致核质过度成熟，引起遗传物质异常。因此，尽管精子可以通过晚期补救ICSI进入卵母细胞，但胚胎发育异常，从而导致优质胚胎率降低及流产。因此，有学者建议在IVF周期6～12h进行早期补救ICSI[9]。王美仙[10]比较了6～8h补救ICSI、8～12h补救ICSI、22h补救ICSI的治疗结局，结果表明6～8h补救ICSI、8～12h补救ICSI的受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率、妊娠率均显著高于22h补救ICSI，而6～8h补救ICSI与8～12h补救ICSI并无显著差异。本研究结果显示，早期补救ICSI的正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率分别为53.4%、93.8%、46.9%、38.5%、31.8%，显著高于晚期补救ICSI。除了早期进入卵母细胞可以降低其异常的风险，早期补救ICSI还能够与最佳子宫内膜种植窗口同步，从而提高妊娠率。早期补救ICSI的关键在于判断IVF受精情况并在最佳的受精时间窗内进行补救ICSI。尽管如此，早期补救ICSI存在一定风险。研究表明，常规IVF后，22%的卵在2～3h后排出第二极体，66%卵在3～4h排出，10%的卵在受精6h后出现延迟排出第二极体的现象，因此在IVF6h未排出第二极体并进行早期补救可能导致3PN的发生。严正杰[11]报道，6～8h补救ICSI与8～12h补救ICSI的3PN发生率分别为8.6%、5.0%。
综上所述，对于常规IVF失败后患者应早期施行补救ICSI进行再受精，能够显著改善常规IVF失败患者的结局。
[参考文献]
[1] 张杨，皮洁.短时受精后补救ICSI与常规受精失败后补救ICSI的比较[J].中国优生与遗传杂志，2011，19（12）：124-124，14.
[2] 王雄，郝翠芳.短时体外受精、及时补救ICSI的临床应用[J].生殖与避孕，2009，31（6）：399-401.
[3] 李明，宋玮，刘平等.75例常规IVF失败后补救ICSI临床结局分析[J].中国优生与遗传杂志，2008，16（6）：112-112，114.
[4] 戴蜜蜜，葛红山，黄朝霞，等.常规IVF受精失败后行补救ICSI与直接ICSI的临床比较分析[J].实用医学杂志，2011，27（6）：984-986.
[5] 王美仙，邵小光.短时受精联合早期补救ICSI技术的应用现状[J].现代妇产科进展，2009，18（11）：863-864，868.
[6] 邹廉，吴曼，蔡立义.常规IVF周期受精失败早期补救ICSI效果观察[J].浙江临床医学，2012，14（8）：945-946.
[7] 彭鹏，樊桂玲，李宜学，等.短时受精失败后行早补救ICSI的临床应用研究[J].中国妇幼保健，2012，27（35）：5751-5753.
[8] 朱丽霞，刘群，吴黎，等.补救ICSI在常规IVF不受精或低受精周期中的应用[J].华中科技大学学报（医学版），2010，39（6）：851-852，859.
[9] 刘素英，曹英，曹翔，等.早期补救ICSI应用价值的初步探讨[J].生殖与避孕，2010，32（11）：742-744，778.
[10] 王美仙，邵小光，张振强，等.不同时间补救ICSI结局的比较分析[J].中国妇幼保健，2011，7（8）：1047-1049.
[11] 严正杰，蔡令波，冯婷，等.对体外受精失败后不同授精时间进行补救ICSI的结局比较[J].生殖与避孕，2009，5（6）：329-332.
（收稿日期：2013-07-15）
[关键词] IVF；补救ICSI；受精率
[中图分类号] R711.6 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）17-25-03
由于卵母细胞及精子方面的原因，可以导致体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中的卵母细胞完全不受精或低受精等情况发生，文献报道，其发生率可达10%～25%[1]。近年来，卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术的发展，使得非男性因素导致上述IVF-ET失败患者有了再次受精的机会[2]。但对何时进行补救ICSI仍存在一定争议，本研究观察了早期补救ICSI与晚期补救ICSI的临床效果，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本院2010年2月～2013年2月收治88例非男性因素不孕患者，不孕因素主要包括输卵管、免疫、盆腔粘连、子宫内膜异位症等因素，上述患者进行常规IVF-ET失败并自愿进行补救ICSI，将88例患者随机分为早期补救组与晚期补救组，早期补救组44例，平均年龄（30.1±5.6）岁，不孕年限（5.7±4.1）年，晚期补救组44例，平均年龄（31.2±6.3）岁，
不孕年限（6.1±4.8）年。本研究经医学伦理委员会通过，并经患者签署知情同意书。早期补救组共44个周期，晚期补救组共44个周期，两组患者在女方年龄、不孕时间、平均每周期获卵数等方面无显著差异（P>0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 促排卵方案 在本生殖中心接受IVF患者采用常规方案促排卵，采用阴道超声检测卵泡发育情况，当超生检查发现卵巢存在2个以上直径18mm以上的卵泡或者3个直径在17mm以上的卵泡时，给予患者5000～10 000IU的HCG注射。34～36h后采用17G取卵针在阴道超声探头下取卵，取卵压力为110mm Hg。
1.2.2 精子准备 采用常规方法处理精子：用上游离心法进行离心后，最终受精液中精子的密度应达到（5～10）×109/mL。
1.2.3 补救ICSI 采用常规IVF后3h加入精子，在精卵结合后6h将卵周颗粒细胞清除。早期补救组在常规受精后4～6h进行观察，晚期补救组在常规受精后16～18h进行观察，若所有卵母细胞均未出现第二极体则判断为未受精，
若出现第二极体的卵母细胞占所有成熟卵母细胞20%以上时判断为低受精，征求上述患者意见是否同意进行补救ICSI。显微注射后选择发育正常的受精卵进行培养，培养至D2或D3期时挑选优质胚胎进行宫腔内移植，将其他胚胎进行冷冻保存。所有患者在采卵当天即开始进行黄体酮注射，植入宫腔14d后检测血β-HCG，若β-HCG>5.3IU/L则判断为生化妊娠，植入宫腔28d后采用超生检查孕囊及胎心搏动，若存在则判断为临床妊娠[3]。
1.3 评价标准
比较两组患者正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率等指标。受精率=受精卵数/补救ICSI卵数×100%，卵裂率=卵裂细胞数/受精卵数×100%，可移植胚胎率=可移植胚胎数/卵裂细胞数×100%，优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂细胞数×100%，妊娠率=妊娠例数/周期数×100%[4]。
1.4 统计学方法
采用SPSS14.0进行统计学分析，对正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率等计数资料采用x2检验，对周期数、女性年龄、不孕年限、平均获卵数等计量资料采用t检验，计量资料采用（）表示，检验水准设定为α=0.05，P<0.05时差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者一般情况的比较
两组患者的周期数、女性年龄、不孕年限、平均获卵数无显著差异（P>0.05）。具体见表1。
2.2 两组患者正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率的比较
早期补救组完全不受精16例，部分不受精28例，补救ICSI成熟卵数420个；晚期补救组完全不受精18例，部分不受精26例，补救ICSI成熟卵数440个。早期补救组正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率均显著高于晚期补救组（P<0.05）。具体见表2。
3 讨论
由于精子和卵子本身缺陷、精卵融合障碍、卵母细胞激活缺陷、不合适的激素环境、卵母细胞胞质胞核发育不同步、遗传物质异常等原因，导致卵母细胞及精子成熟、精子获能、精子透明带结合、精卵融合、卵细胞激活等受精过程任一环节异常，均可引起受精失败。文献报道，常规IVF受精率为60%～70%，而完全不受精或低受精率可达10%～20%[5]。
有学者建议采用补救ICSI的方法挽救受精失败的卵母细胞，从而避免取消周期。但由于补救ICSI受精率及临床妊娠率均较低，因此限制了其在国内生殖中心的广泛开展。邹廉[6]认为造成补救ICSI受精率、妊娠率、出生率较低的原因主要包括两个原因：（1）卵母细胞体外培养可造成卵子染色体异常，而其异常几率与体外培养时间成正相关，而卵子染色体异常可直接导致胚胎发育潜能异常；（2）补救ICSI受精成功的卵裂之后，从而造成与子宫内膜发育不同步，不利于胚胎着床[7]。根据实施补救ICSI时间不同，补救ICSI可分为早期补救ICSI与晚期补救ICSI。目前大多数生殖中心采用常规IVF不受精后18～22h进行晚期补救ICSI，其受精率可达20%～60%。尽管如此，晚期补救ICSI的卵裂率、优质胚胎率、妊娠率均较低。朱丽霞[8]报道，采用晚期补救ICSI正常受精率达到72.3%，但卵裂率、优质胚胎率、妊娠率仅为86.2%、21.3%、2.9%。本研究结果与其一致，晚期补救组正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率分别为46.1%、82.8%、32.1%、23.8%、6.8%。导致晚期补救ICSI妊娠率较低的主要原因为卵母细胞异常，优于卵母细胞未受精且在体外环境培养时间较长，导致核质过度成熟，引起遗传物质异常。因此，尽管精子可以通过晚期补救ICSI进入卵母细胞，但胚胎发育异常，从而导致优质胚胎率降低及流产。因此，有学者建议在IVF周期6～12h进行早期补救ICSI[9]。王美仙[10]比较了6～8h补救ICSI、8～12h补救ICSI、22h补救ICSI的治疗结局，结果表明6～8h补救ICSI、8～12h补救ICSI的受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率、妊娠率均显著高于22h补救ICSI，而6～8h补救ICSI与8～12h补救ICSI并无显著差异。本研究结果显示，早期补救ICSI的正常受精率、卵裂率、可移植胚胎率、优质胚胎率与妊娠率分别为53.4%、93.8%、46.9%、38.5%、31.8%，显著高于晚期补救ICSI。除了早期进入卵母细胞可以降低其异常的风险，早期补救ICSI还能够与最佳子宫内膜种植窗口同步，从而提高妊娠率。早期补救ICSI的关键在于判断IVF受精情况并在最佳的受精时间窗内进行补救ICSI。尽管如此，早期补救ICSI存在一定风险。研究表明，常规IVF后，22%的卵在2～3h后排出第二极体，66%卵在3～4h排出，10%的卵在受精6h后出现延迟排出第二极体的现象，因此在IVF6h未排出第二极体并进行早期补救可能导致3PN的发生。严正杰[11]报道，6～8h补救ICSI与8～12h补救ICSI的3PN发生率分别为8.6%、5.0%。
综上所述，对于常规IVF失败后患者应早期施行补救ICSI进行再受精，能够显著改善常规IVF失败患者的结局。
[参考文献]
[1] 张杨，皮洁.短时受精后补救ICSI与常规受精失败后补救ICSI的比较[J].中国优生与遗传杂志，2011，19（12）：124-124，14.
[2] 王雄，郝翠芳.短时体外受精、及时补救ICSI的临床应用[J].生殖与避孕，2009，31（6）：399-401.
[3] 李明，宋玮，刘平等.75例常规IVF失败后补救ICSI临床结局分析[J].中国优生与遗传杂志，2008，16（6）：112-112，114.
[4] 戴蜜蜜，葛红山，黄朝霞，等.常规IVF受精失败后行补救ICSI与直接ICSI的临床比较分析[J].实用医学杂志，2011，27（6）：984-986.
[5] 王美仙，邵小光.短时受精联合早期补救ICSI技术的应用现状[J].现代妇产科进展，2009，18（11）：863-864，868.
[6] 邹廉，吴曼，蔡立义.常规IVF周期受精失败早期补救ICSI效果观察[J].浙江临床医学，2012，14（8）：945-946.
[7] 彭鹏，樊桂玲，李宜学，等.短时受精失败后行早补救ICSI的临床应用研究[J].中国妇幼保健，2012，27（35）：5751-5753.
[8] 朱丽霞，刘群，吴黎，等.补救ICSI在常规IVF不受精或低受精周期中的应用[J].华中科技大学学报（医学版），2010，39（6）：851-852，859.
[9] 刘素英，曹英，曹翔，等.早期补救ICSI应用价值的初步探讨[J].生殖与避孕，2010，32（11）：742-744，778.
[10] 王美仙，邵小光，张振强，等.不同时间补救ICSI结局的比较分析[J].中国妇幼保健，2011，7（8）：1047-1049.
[11] 严正杰，蔡令波，冯婷，等.对体外受精失败后不同授精时间进行补救ICSI的结局比较[J].生殖与避孕，2009，5（6）：329-332.
（收稿日期：2013-07-15）