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摘要 利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）处理“巴西蕉”无菌增殖芽，突变体通过L-羟脯氨酸（HYP）定向筛选，经低温胁迫筛选出抗性较强的突变体。利用形态观察、生理生化指标等手段鉴定突变体。结果表明，EMS诱变处理“巴西蕉”无菌增殖芽适宜的浓度和时间组合为1.5%+3 h;经HYP筛选的突变体在低温胁迫后，其叶片脯氨酸含量提高、丙二醛含量降低、过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性增强;诱变后的表型突变主要包括叶片颜色、叶片性状和株型的变异。该研究为高效诱变香蕉提供技术参考及后期选育优良品种提供材料。
关键词 香蕉;甲基磺酸乙酯（EMS）;抗寒突变体;羟脯氨酸（L-HYP）
中图分类号 S 668.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）19-0041-06
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.19.011
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Establishment and Screening of Banana Cold-resistant Germplasm by EMS
XU Zhu-ye1，2，WANG An-bang2， LI Yu-jia2 et al
（1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 571101; 2. Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101）
Abstract The chemical mutagens ethyl methanesulfonate （EMS） were used to treat the aseptic propagation buds of Baxijiao， and then mutants were obtained through L-hydroxyproline （L-HYP） directed screening， and more resistant mutants were screened out through low temperature stress. Morphological observation， physiological and biochemical indicators were used to identify mutants. The results showed that the suitable concentration and time combination for EMS mutagenesis to treat the aseptic proliferation shoots of Baxijiao was 1.5%+3 h; after low temperature stress， the mutants screened by HYP have increased proline content， decreased malondialdehyde content， increased peroxidase and catalase activities;the phenotypic mutation of surviving plants after mutation mainly included the variation of leaf color， leaf traits and plant type.This research provides technical reference for high-efficiency mutagenesis of bananas and materials for later selection of elite varieties.
Key words Banana;Ethyl methanesulfonate（EMS）;Cold resistance mutant;L-hydroxyproline（HYP）
基金项目 现代农业产业体系专项资金（CARS-31-02）;海南省科技廳重点研发计划（ZDYF2016054）。
作者简介 许竹叶（1994—），女，海南文昌人，硕士研究生，研究方向：热带园艺与种苗。*通信作者，副研究员，硕士，从事作物遗传育种研究。
收稿日期 2021-04-21;修回日期 2021-06-03
香蕉是一种重要的热带水果，被世界粮农组织（FAO）认定为发展中国家仅次于水稻、玉米和小麦的第四大粮食作物（food and agriculture organization，FAO）。然而，香蕉作为一种热带作物，容易受到寒害的影响，导致栽培面积逐年减小，果实品质下降、产量降低，甚至绝收，造成严重经济损失。因此培育出高产、优质同时又具有抗寒特性的香蕉品种，对香蕉产业的可持续发展尤为重要。目前香蕉新品种选育方法有杂交育种、分子育种和诱变育种等。香蕉杂交育种技术对于香蕉而言，具有很大的难度且育种周期长;现代分子育种具有快速、准确、不受环境干扰的特点，但技术要求较高，并在一些国家受制于法律约束;而诱变育种在较短时间内获得有价值的突变体，且具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广等特点。
诱变育种分为化学诱变和物理诱变。物理诱变是通过物理辐射能处理植物材料，改变植物遗传物质，获得多种变异类型，丰富遗传资源[1]。物理诱变实现基因重组，具有丰富种质资源、保持优良特性、改良个别不良特性和育种年限短等特点，物理诱变主要有X射线、γ射线、β射线、中子、激光、紫外线等。化学诱变育种是指使用化学诱变剂使植物遗传物质发生改变，将具有优良农艺性状的变异材料选育成新品种的方法。相对于物理诱变而言，化学诱变具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广、诱变效应在M1中表现明显和获得有益变异概率高等特点，但突变频率低。化学诱变剂包括烷化剂、碱基类似物及有关化合物、叠氮化物、抗生素、吖啶、羟胺等。其中烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）是较为常用的化学诱变剂，具有高效率和低毒性、诱导等位基因发生点突变的特点。目前，利用EMS已经成功构建了油菜、柑橘、白桦、黄瓜、木豆、麻风树等植物的突变体库[2-8]。何慧怡等[9]采用EMS诱变处理甘蔗茎尖，得到了“粤糖9-159”“新台糖22”这2个新品系。孙慧[10]利用EMS诱变技术对海滨木槿种子进行诱变，获得了抗寒性较强的新品系。杨宁[11]采用EMS诱变技术对番茄“Heinz 1706”进行诱变处理，获得了矮化突变体。这些研究表明植物经EMS诱变筛选可获得具有目标性状的突变体，为后面选育新品种奠定了基础。研究表明，在化学诱变过程中，以羟脯氨酸（L-HYP）作为选择压进行定向筛选，可获得抗性较强的突变体材料[12-14]。 笔者利用“巴西蕉”无菌增殖芽为外植体，进行EMS诱变并结合羟脯氨酸（L-HYP）压力筛选，进而定向筛选获得抗寒性较强的“巴西蕉”变异体，利用形态观察、生理生化指标等手段鉴定突变体，揭示通过化学诱变及L-HYP筛选可影响其抗寒能力，为香蕉的抗性育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
“巴西蕉”（ Musa acuminata ，subgroup Cavendish）品种，来自中国热带农业科学院海口实验站儋州试验基地香蕉资源圃，采用健康笋芽，以此为外植体，建立无性再生系，获得无菌增殖芽。
1.2 方法
1.2.1 EMS溶液及磷酸缓冲液的制备。
磷酸缓冲液的配制参照任雪羽[15]的方法改进，配制0.1 mol/L的A液和B液;称取NaH 2PO 4 71.64 g溶解于蒸馏水中，定容到1 L配成A液;称取Na 2HPO 4 31.21 g溶于蒸馏水中，定容到1 L配成B液。取0.46 L的甲液和0.305 L的B液，蒸馏水定容到1 L，配制成pH 5.9 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，高温灭菌备用。
EMS溶液的配制：EMS抽取过滤法，用0.1 mol/L、pH 59的磷酸缓冲液依次配制浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、10%、1.5%、2.0% 7个梯度的EMS溶液。
1.2.2 EMS诱变处理。
采取浸摇法进行诱变。选取生长基本一致、健壮的无菌增殖香蕉芽置于不同浓度的诱变液中，之后放入25 ℃、120 r/min的摇床内分别浸摇2、3、4 h，随后丢弃EMS溶液，再用灭菌后冷却至室温的蒸馏水清洗5～6遍，无菌增殖芽放在滤纸上吸干水分后接在增殖培养基上进行培养，20 d后记录无菌增殖芽的存活率、分化率及增殖系数。确定合适的诱变组合后，将全部存活的无菌芽转接至生根培养基中培养25 d并记录根长及茎高，将根部的培养基洗净后进行移栽，移栽在椰糠与蛭石比为1∶1的混合基质中。等其长至五叶一心时进行观察，并记录变异性状。增殖培养基和生根培养基配制配方见表1。
1.2.3 羟脯氨酸（HYP）定向筛选。
利用适宜的EMS诱变组合重新诱变大量的无菌增殖芽苗用于HYP筛选。将EMS诱变处理后存活的无菌芽转接到含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的HYP培养基上，未经诱变的“巴西蕉”无菌芽转接到含有不同浓度的HYP培养基中作为对照，培养25 d计算无菌增殖芽的成活率，每组处理30株，重复3次，然后筛选出适宜的选择压。将存活无菌增殖芽继续转接到含HYP选择压浓度的继代培养基中培养20 d，再将存活的无菌增殖芽接入不含HYP的继代培养基中培养20 d，反复2次，最后存活下来的无菌芽用于后续鉴定。
1.2.4 低温诱导及诱变植株抗寒性生理生化性检测。
将经HYP定向筛选后存活的诱变无菌苗，依次在13、10、7、4 ℃的低温胁迫下各处理8 h，以未经EMS及HYP处理的不定芽作为对照，同一位置的叶片进行脯氨酸含量、丙二醛含量（MDA）、过氧化物酶活性（POD）、过氧化氢酶活性（CAT）生理指标测定。
1.3 数据统计
试验数据采用SAS、SigmaPlot 12.0和Grapad prism7.0软件完成。
致死率=（死亡株数/接种株数）×100%
分化率=（分化株数/接种株数）×100%
增殖系数=有效芽数/接种株数
变异率=（变异株数/移栽株數）×100%
2 结果与分析
2.1 EMS浓度和诱变时间对“巴西蕉”无菌增殖芽的影响
根据2种不同因素水平，对其影响无菌增殖芽的致死率进行Two-way ANOVA方差分析。由表2和表3可知，EMS浓度和处理时间均对无菌增殖芽的致死率与分化率有极显著的影响（ P <0.01）。因此无菌增殖芽的致死率、分化率与EMS浓度和处理时间有关。
根据“巴西蕉”无菌增殖芽的生长状态与EMS浓度和处理时间的极显著相关性。从表4可以看出，“巴西蕉”无菌增殖芽致死率随着EMS浓度的增大及处理时间的延长逐渐上升，EMS浓度愈高，诱变浸泡处理时间愈长，对无菌增殖芽致死率的影响越大。对照组（0.0%EMS）各处理时间无菌增殖芽的致死率无显著差异。当EMS为高浓度时（1.0%～20%），每个处理时间无菌增殖芽的致死率均呈显著差异（ P <0.05）。当EMS浓度为2.0%，诱变处理时间为4 h，无菌增殖芽致死率高达93.94%。浓度为1.0%，诱变处理时间为4 h时，无菌增殖芽致死率为48.48%。其中1.0%EMS+4 h和1.5%+3 h组合的致死率均接近50%，分别为48.48%和46.29%。
无菌增殖芽分化率和增殖系数均随着EMS浓度的升高和处理时间的加长而呈逐渐下降的趋势。当EMS在较高浓度时（1.0%～2.0%），每个处理时间无菌增殖芽的分化率均呈显著差异（ P <0.05）。各个浓度的处理时间之间无菌增殖芽的增殖系数均呈显著差异（ P <0.05）。当EMS浓度提高到2.0%，诱变处理时间为4 h时，无菌增殖芽分化和增殖能力极弱，分化率和增殖系数分别为0.76%和0.045。说明高浓度的诱变剂和长的处理时间，对无菌增殖芽的分化生长有抑制作用。1.0%EMS+4 h和1.5%EMS+3 h组合无菌增殖芽的致死率、分化率和增殖系数均无显著差异。因筛选EMS诱变半致死量时外植体的致死率需在40%～60%及EMS浓度比处理时间的影响大，使用高浓度的诱变剂获得变异突变体概率大[2]。故EMS诱变处理“巴西蕉”无菌增殖芽适宜条件为1.5%EMS+3 h。
2.2 EMS浓度和诱变时间对诱变株系根长和茎高的影响 经EMS诱变处理后的“巴西蕉”无菌增殖芽，转入生根培养基培养25 d后，记录其根长和茎高。由图1～2可知，EMS处理可以影响“巴西蕉”无菌苗的根长及茎高。随着EMS浓度的增加和处理时间的延长，“巴西蕉”无菌苗的根越来越短，生长愈缓慢。对照组（0%EMS）3个时间处理的根长及茎高均无显著差异，且均高于其余浓度。EMS浓度为0.2%～2.0%时，处理2 h，根长显著高于其他处理（ P <0.05）。当EMS诱变浓度为2.0%，处理时间为2 h时，其根长为593 cm，处理时间为3和4 h时，根长分别0.77和0.03 cm。诱变浓度为0、1.5%、2.0%的ESM，处理3与4 h，根长无显著差异。诱变浓度为2.0%，处理4 h时，无菌苗无根生长。诱变浓度为0时，3个处理时间的茎高均无显著差异。浓度为1.0%时，处理时间2、3和4 h存在显著差异（ P <005），3和4 h的茎高无显著差异，茎高分别为3.51、2.19和1.88 cm。说明过高的ESM浓度和处理时间过长，对植物细胞造成一定的伤害，抑制了根的生长和株高。
2.3 EMS诱变对植株表型的影响
EMS处理对“巴西蕉”无菌增殖芽造成损伤，明显抑制了无菌增殖苗的生长。与未经EMS诱变相比，诱变处理整体表现为无菌增殖芽分化时间推迟（图3A、B），幼苗植株矮小及根短（图3C）。与对照相比，诱变组培苗开始出现特殊性状，如叶片细小，植株矮化，叶片向下卷曲（图3D、F）。
当植株长至五叶一心时，突变体主要表现为叶色突变、叶型突变和株型突变等表型。统计1.5%+3 h EMS诱变处理的“巴西蕉”株系，由表5可知，植株矮化或半矮化率为1667%，个别植株极矮小。叶型突变株出现叶缘褶皱、叶片卷曲和窄长叶，其中叶缘褶皱率为13.33%，叶片卷曲率为500%，窄长叶率为10.00%，椭圆叶为5.00%。叶片上有黄条纹和亮绿叶，其中出现黄条纹率为8.33%，亮绿叶率为667%。窄长叶、叶片卷曲和植株矮小在组培苗期表型比较明显，其中窄长叶和叶片卷曲在后期生长过程中突变表型出现逐渐减弱现象。可能是EMS诱变对外植体产生的诱变作用在后期生长中被环境影响，其生理损失出现修复或减弱现象（图4）。
2.4 不同浓度的HYP对无菌苗存活率的影响
由表6可知，在对照组中，当HYP浓度小于0.6 mmol/L时，无菌增殖芽的存活率为68.9%，说明“巴西蕉”无菌增殖芽可以耐受一定浓度的HYP。当浓度增加到1.2 mmol/L时，无菌增殖芽存活率仅为5.6%。在同一浓度下，处理组无菌增殖芽的存活率显著高于对照组（ P <0.05），当HYP浓度为1.0 mmol/L时，处理组无菌增殖芽的存活率为29%，对照组的存活率为11.0%。可能是EMS诱变可以使植物细胞发生突变且抗HYP基因得到表达，所以能在高浓度的HYP环境中生存下来。当HYP浓度为0.8 mmol/L时，组培苗的存活率为556%，而当HYP浓度为1.0 mmol/L时，无菌芽的存活率为29.0%，HYP浓度继续增加到1.2 mmol/L时，存活率为178%，为了较大概率筛选到抗性突变体，且保证有足够数量的无菌苗进行后续试验，故把1.0 mmol/L的HYP作为选择压。
2.5 EMS诱变材料经HYP筛选后获得的抗寒突变体对低温胁迫的生理响应
2.5.1 不同低温胁迫对CAT、POD活力的影响。
低温胁迫会导致植物细胞内自由基的产生和清除失去平衡，积累过多的活性氧，细胞膜的结构和功能会被累积过量的活性氧给破坏[16]，而POD、CAT是清除活性氧主要酶。由图5可知，处理组POD、CAT的活性均比对照组高。CAT的活性随着胁迫温度的降低呈先增加而后降低的趋势，7 ℃时达到最高。在13 ℃时，2组CAT活性相差不大，而在7 ℃时，处理组的CAT活性比对照组高11.72%。POD活性随着温度的下降呈逐渐上升的趋势，在各个低温胁迫时，处理组的POD活性比对照组高。在7 ℃时，对照组POD含量为467.13 U/（min·g），对照组为734.6 U/（min·g）。在4 ℃时POD活性最高，处理组是对照组的2.03倍。表明EMS诱变经HYP筛选后得到的诱变植株清除活性氧的能力比对照株强，说明EMS诱变经HYP筛选后得到的诱变植株具有较强的抗寒力。
2.5.2 不同低温胁迫对MDA、脯氨酸含量的影响。
MDA是植物遭受氧化损伤时产生的膜脂质过氧化产物，反映膜受损的程度，可作为抗寒能力的指标[17]。由图6可知，MDA含量随着胁迫温度的降低而逐渐增加，处理组MDA的含量始终低于对照组，在4 ℃时MDA含量最高，处理组为199.14 μg/g，对照组为148.63 μg/g。说明EMS诱变筛选后的诱变株细胞膜的受损程度比对照组小。
脯氨酸是植物重要的渗透调节物质。在逆境条件下，植物中脯氨酸含量会明显增加，其含量的增加量在一定程度上反映了植物的抗逆性。因此。脯氨酸的增加量可作为抗逆育种的生理指标之一。由图6可知，随着温度的下降，脯氨酸的含量呈逐渐上升的趋势，处理组脯氨酸含量明显高于对照组，处理组在4 ℃时脯氨酸含量最高，为3.043 μg/g，明显高于对照组的1.51 μg/g。说明在低温胁迫下，EMS诱变筛选后的“巴西蕉”诱变株可以提高脯氨酸的积累量，抗逆能力比对照株强。
3 结论与讨论
香蕉是典型的热带亚热带果树，喜高温怕低温，低温是香蕉生产中的主要限制性因素之一。因此选育香蕉抗寒品种是解决香蕉寒害问题的根本出路。目前香蕉新品种选育方法有杂交育种、现代生物技术育种和诱变育种等。而大部分栽培品种香蕉是多倍体，具有亲本高度不育的特点，因此通过传统杂交育种方式培育和改良香蕉品种相对比较困难且育种周期较长。另外现代分子育种虽具有快速、准确、不受环境干扰的特点，但技术要求较高且操作程序复杂，并在一些国家受制于法律约束。而诱变育种可在较短时间内获得有价值的突变体，且具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广的特点。该试验采用“巴西蕉”无菌增殖芽作为外植體，利用不同浓度的EMS诱变剂和诱变时间诱导变异，诱变后的外植体经过不同浓度的L-HYP定向筛选，可获得抗寒突变体。 3.1 EMS诱变适宜条件的确定
以经一定浓度诱变剂及时间处理的材料的半致死率作为筛选标准，是为了获得较高的突变率及保证有一定数量的诱变材料。因此，选择诱变浓度和时间极为重要，但不同的处理材料，其适宜的诱变浓度和处理时间也不同。尚静等[18]研究EMS诱变茄子种子时，确定了0.5%EMS处理6 h和1.0%EMS处理4 h为半致死量，其致死率均接近50%。齐晓花等[19]研究EMS诱变构建黄瓜突变体库时，确定了黄瓜“YZ-01”的半致死量为1.5%。刘艳萌等[20]研究发现EMS溶液处理草莓离体叶片适宜处理条件为0.2%+2.0 h和0.4%+1.0 h，EMS诱变愈伤组织的适宜条件为0.1%+1.5 h和0.2%+1.0 h。孙慧[10]利用1.5%EMS+4 h对海滨木槿种子进行诱变，获得了抗寒性较强的新品系。该试验中，2.0%的EMS处理4 h时，其无菌增殖芽达到完全褐化死亡状态，可能是由于EMS浓度过高和时间过长导致诱变剂对无菌增殖芽的毒害作用过强。当EMS的诱变条件为1.5%EMS+3 h和1.0%EMS+4 h，无菌增殖芽的致死率分别为45.37%和46.97%，虽两者都不是半致死剂量，但致死率均接近半致死率。祁伟[2]研究表明，诱变剂浓度比处理时间的影响大，使用高浓度的诱变剂获得变异突变体概率大。同时考虑分化率因素，该试验确定EMS诱变“巴西蕉”无菌增殖芽的适宜条件为1.5%EMS+3 h，为后期选育优良的香蕉品种提供材料。同时为EMS诱变“巴西蕉”无菌增殖芽提供参考。
3.2 HYP对无菌苗成活的影响
L-HYP定向筛选香蕉无菌苗的文献尚未见报道。L-HYP是脯氨酸类似物，HYP是脯氨酸的类似物，它可以与脯氨酸竞争，反馈和抑制脯氨酸合成过程中的谷氨酸激酶，对植物组织造成损害，植物组织需要产生大量的脯氨酸来降低HYP的比例才能生存。因此
研究区农业用地适宜用地主要集中在中部，其余分布于南部，西北部和东部少。一般适宜用地仍主要集中在中部，其余分布于南部，西北部和东部少。较不适宜用地呈零散状分布于适宜用地和一般适宜用地的边缘。不适宜用地主要集中于东部和西部。禁止用地面积主要集中在西南部，东部次之，最南部和最北部分布较少。
参考文献
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Abstract The chemical mutagens ethyl methanesulfonate （EMS） were used to treat the aseptic propagation buds of Baxijiao， and then mutants were obtained through L-hydroxyproline （L-HYP） directed screening， and more resistant mutants were screened out through low temperature stress. Morphological observation， physiological and biochemical indicators were used to identify mutants. The results showed that the suitable concentration and time combination for EMS mutagenesis to treat the aseptic proliferation shoots of Baxijiao was 1.5%+3 h; after low temperature stress， the mutants screened by HYP have increased proline content， decreased malondialdehyde content， increased peroxidase and catalase activities;the phenotypic mutation of surviving plants after mutation mainly included the variation of leaf color， leaf traits and plant type.This research provides technical reference for high-efficiency mutagenesis of bananas and materials for later selection of elite varieties.
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作者简介 许竹叶（1994—），女，海南文昌人，硕士研究生，研究方向：热带园艺与种苗。*通信作者，副研究员，硕士，从事作物遗传育种研究。
收稿日期 2021-04-21;修回日期 2021-06-03
香蕉是一种重要的热带水果，被世界粮农组织（FAO）认定为发展中国家仅次于水稻、玉米和小麦的第四大粮食作物（food and agriculture organization，FAO）。然而，香蕉作为一种热带作物，容易受到寒害的影响，导致栽培面积逐年减小，果实品质下降、产量降低，甚至绝收，造成严重经济损失。因此培育出高产、优质同时又具有抗寒特性的香蕉品种，对香蕉产业的可持续发展尤为重要。目前香蕉新品种选育方法有杂交育种、分子育种和诱变育种等。香蕉杂交育种技术对于香蕉而言，具有很大的难度且育种周期长;现代分子育种具有快速、准确、不受环境干扰的特点，但技术要求较高，并在一些国家受制于法律约束;而诱变育种在较短时间内获得有价值的突变体，且具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广等特点。
诱变育种分为化学诱变和物理诱变。物理诱变是通过物理辐射能处理植物材料，改变植物遗传物质，获得多种变异类型，丰富遗传资源[1]。物理诱变实现基因重组，具有丰富种质资源、保持优良特性、改良个别不良特性和育种年限短等特点，物理诱变主要有X射线、γ射线、β射线、中子、激光、紫外线等。化学诱变育种是指使用化学诱变剂使植物遗传物质发生改变，将具有优良农艺性状的变异材料选育成新品种的方法。相对于物理诱变而言，化学诱变具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广、诱变效应在M1中表现明显和获得有益变异概率高等特点，但突变频率低。化学诱变剂包括烷化剂、碱基类似物及有关化合物、叠氮化物、抗生素、吖啶、羟胺等。其中烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）是较为常用的化学诱变剂，具有高效率和低毒性、诱导等位基因发生点突变的特点。目前，利用EMS已经成功构建了油菜、柑橘、白桦、黄瓜、木豆、麻风树等植物的突变体库[2-8]。何慧怡等[9]采用EMS诱变处理甘蔗茎尖，得到了“粤糖9-159”“新台糖22”这2个新品系。孙慧[10]利用EMS诱变技术对海滨木槿种子进行诱变，获得了抗寒性较强的新品系。杨宁[11]采用EMS诱变技术对番茄“Heinz 1706”进行诱变处理，获得了矮化突变体。这些研究表明植物经EMS诱变筛选可获得具有目标性状的突变体，为后面选育新品种奠定了基础。研究表明，在化学诱变过程中，以羟脯氨酸（L-HYP）作为选择压进行定向筛选，可获得抗性较强的突变体材料[12-14]。 笔者利用“巴西蕉”无菌增殖芽为外植体，进行EMS诱变并结合羟脯氨酸（L-HYP）压力筛选，进而定向筛选获得抗寒性较强的“巴西蕉”变异体，利用形态观察、生理生化指标等手段鉴定突变体，揭示通过化学诱变及L-HYP筛选可影响其抗寒能力，为香蕉的抗性育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
“巴西蕉”（ Musa acuminata ，subgroup Cavendish）品种，来自中国热带农业科学院海口实验站儋州试验基地香蕉资源圃，采用健康笋芽，以此为外植体，建立无性再生系，获得无菌增殖芽。
1.2 方法
1.2.1 EMS溶液及磷酸缓冲液的制备。
磷酸缓冲液的配制参照任雪羽[15]的方法改进，配制0.1 mol/L的A液和B液;称取NaH 2PO 4 71.64 g溶解于蒸馏水中，定容到1 L配成A液;称取Na 2HPO 4 31.21 g溶于蒸馏水中，定容到1 L配成B液。取0.46 L的甲液和0.305 L的B液，蒸馏水定容到1 L，配制成pH 5.9 0.1 mol/L的磷酸缓冲液，高温灭菌备用。
EMS溶液的配制：EMS抽取过滤法，用0.1 mol/L、pH 59的磷酸缓冲液依次配制浓度为0、0.2%、0.4%、0.6%、10%、1.5%、2.0% 7个梯度的EMS溶液。
1.2.2 EMS诱变处理。
采取浸摇法进行诱变。选取生长基本一致、健壮的无菌增殖香蕉芽置于不同浓度的诱变液中，之后放入25 ℃、120 r/min的摇床内分别浸摇2、3、4 h，随后丢弃EMS溶液，再用灭菌后冷却至室温的蒸馏水清洗5～6遍，无菌增殖芽放在滤纸上吸干水分后接在增殖培养基上进行培养，20 d后记录无菌增殖芽的存活率、分化率及增殖系数。确定合适的诱变组合后，将全部存活的无菌芽转接至生根培养基中培养25 d并记录根长及茎高，将根部的培养基洗净后进行移栽，移栽在椰糠与蛭石比为1∶1的混合基质中。等其长至五叶一心时进行观察，并记录变异性状。增殖培养基和生根培养基配制配方见表1。
1.2.3 羟脯氨酸（HYP）定向筛选。
利用适宜的EMS诱变组合重新诱变大量的无菌增殖芽苗用于HYP筛选。将EMS诱变处理后存活的无菌芽转接到含0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的HYP培养基上，未经诱变的“巴西蕉”无菌芽转接到含有不同浓度的HYP培养基中作为对照，培养25 d计算无菌增殖芽的成活率，每组处理30株，重复3次，然后筛选出适宜的选择压。将存活无菌增殖芽继续转接到含HYP选择压浓度的继代培养基中培养20 d，再将存活的无菌增殖芽接入不含HYP的继代培养基中培养20 d，反复2次，最后存活下来的无菌芽用于后续鉴定。
1.2.4 低温诱导及诱变植株抗寒性生理生化性检测。
将经HYP定向筛选后存活的诱变无菌苗，依次在13、10、7、4 ℃的低温胁迫下各处理8 h，以未经EMS及HYP处理的不定芽作为对照，同一位置的叶片进行脯氨酸含量、丙二醛含量（MDA）、过氧化物酶活性（POD）、过氧化氢酶活性（CAT）生理指标测定。
1.3 数据统计
试验数据采用SAS、SigmaPlot 12.0和Grapad prism7.0软件完成。
致死率=（死亡株数/接种株数）×100%
分化率=（分化株数/接种株数）×100%
增殖系数=有效芽数/接种株数
变异率=（变异株数/移栽株數）×100%
2 结果与分析
2.1 EMS浓度和诱变时间对“巴西蕉”无菌增殖芽的影响
根据2种不同因素水平，对其影响无菌增殖芽的致死率进行Two-way ANOVA方差分析。由表2和表3可知，EMS浓度和处理时间均对无菌增殖芽的致死率与分化率有极显著的影响（ P <0.01）。因此无菌增殖芽的致死率、分化率与EMS浓度和处理时间有关。
根据“巴西蕉”无菌增殖芽的生长状态与EMS浓度和处理时间的极显著相关性。从表4可以看出，“巴西蕉”无菌增殖芽致死率随着EMS浓度的增大及处理时间的延长逐渐上升，EMS浓度愈高，诱变浸泡处理时间愈长，对无菌增殖芽致死率的影响越大。对照组（0.0%EMS）各处理时间无菌增殖芽的致死率无显著差异。当EMS为高浓度时（1.0%～20%），每个处理时间无菌增殖芽的致死率均呈显著差异（ P <0.05）。当EMS浓度为2.0%，诱变处理时间为4 h，无菌增殖芽致死率高达93.94%。浓度为1.0%，诱变处理时间为4 h时，无菌增殖芽致死率为48.48%。其中1.0%EMS+4 h和1.5%+3 h组合的致死率均接近50%，分别为48.48%和46.29%。
无菌增殖芽分化率和增殖系数均随着EMS浓度的升高和处理时间的加长而呈逐渐下降的趋势。当EMS在较高浓度时（1.0%～2.0%），每个处理时间无菌增殖芽的分化率均呈显著差异（ P <0.05）。各个浓度的处理时间之间无菌增殖芽的增殖系数均呈显著差异（ P <0.05）。当EMS浓度提高到2.0%，诱变处理时间为4 h时，无菌增殖芽分化和增殖能力极弱，分化率和增殖系数分别为0.76%和0.045。说明高浓度的诱变剂和长的处理时间，对无菌增殖芽的分化生长有抑制作用。1.0%EMS+4 h和1.5%EMS+3 h组合无菌增殖芽的致死率、分化率和增殖系数均无显著差异。因筛选EMS诱变半致死量时外植体的致死率需在40%～60%及EMS浓度比处理时间的影响大，使用高浓度的诱变剂获得变异突变体概率大[2]。故EMS诱变处理“巴西蕉”无菌增殖芽适宜条件为1.5%EMS+3 h。
2.2 EMS浓度和诱变时间对诱变株系根长和茎高的影响 经EMS诱变处理后的“巴西蕉”无菌增殖芽，转入生根培养基培养25 d后，记录其根长和茎高。由图1～2可知，EMS处理可以影响“巴西蕉”无菌苗的根长及茎高。随着EMS浓度的增加和处理时间的延长，“巴西蕉”无菌苗的根越来越短，生长愈缓慢。对照组（0%EMS）3个时间处理的根长及茎高均无显著差异，且均高于其余浓度。EMS浓度为0.2%～2.0%时，处理2 h，根长显著高于其他处理（ P <0.05）。当EMS诱变浓度为2.0%，处理时间为2 h时，其根长为593 cm，处理时间为3和4 h时，根长分别0.77和0.03 cm。诱变浓度为0、1.5%、2.0%的ESM，处理3与4 h，根长无显著差异。诱变浓度为2.0%，处理4 h时，无菌苗无根生长。诱变浓度为0时，3个处理时间的茎高均无显著差异。浓度为1.0%时，处理时间2、3和4 h存在显著差异（ P <005），3和4 h的茎高无显著差异，茎高分别为3.51、2.19和1.88 cm。说明过高的ESM浓度和处理时间过长，对植物细胞造成一定的伤害，抑制了根的生长和株高。
2.3 EMS诱变对植株表型的影响
EMS处理对“巴西蕉”无菌增殖芽造成损伤，明显抑制了无菌增殖苗的生长。与未经EMS诱变相比，诱变处理整体表现为无菌增殖芽分化时间推迟（图3A、B），幼苗植株矮小及根短（图3C）。与对照相比，诱变组培苗开始出现特殊性状，如叶片细小，植株矮化，叶片向下卷曲（图3D、F）。
当植株长至五叶一心时，突变体主要表现为叶色突变、叶型突变和株型突变等表型。统计1.5%+3 h EMS诱变处理的“巴西蕉”株系，由表5可知，植株矮化或半矮化率为1667%，个别植株极矮小。叶型突变株出现叶缘褶皱、叶片卷曲和窄长叶，其中叶缘褶皱率为13.33%，叶片卷曲率为500%，窄长叶率为10.00%，椭圆叶为5.00%。叶片上有黄条纹和亮绿叶，其中出现黄条纹率为8.33%，亮绿叶率为667%。窄长叶、叶片卷曲和植株矮小在组培苗期表型比较明显，其中窄长叶和叶片卷曲在后期生长过程中突变表型出现逐渐减弱现象。可能是EMS诱变对外植体产生的诱变作用在后期生长中被环境影响，其生理损失出现修复或减弱现象（图4）。
2.4 不同浓度的HYP对无菌苗存活率的影响
由表6可知，在对照组中，当HYP浓度小于0.6 mmol/L时，无菌增殖芽的存活率为68.9%，说明“巴西蕉”无菌增殖芽可以耐受一定浓度的HYP。当浓度增加到1.2 mmol/L时，无菌增殖芽存活率仅为5.6%。在同一浓度下，处理组无菌增殖芽的存活率显著高于对照组（ P <0.05），当HYP浓度为1.0 mmol/L时，处理组无菌增殖芽的存活率为29%，对照组的存活率为11.0%。可能是EMS诱变可以使植物细胞发生突变且抗HYP基因得到表达，所以能在高浓度的HYP环境中生存下来。当HYP浓度为0.8 mmol/L时，组培苗的存活率为556%，而当HYP浓度为1.0 mmol/L时，无菌芽的存活率为29.0%，HYP浓度继续增加到1.2 mmol/L时，存活率为178%，为了较大概率筛选到抗性突变体，且保证有足够数量的无菌苗进行后续试验，故把1.0 mmol/L的HYP作为选择压。
2.5 EMS诱变材料经HYP筛选后获得的抗寒突变体对低温胁迫的生理响应
2.5.1 不同低温胁迫对CAT、POD活力的影响。
低温胁迫会导致植物细胞内自由基的产生和清除失去平衡，积累过多的活性氧，细胞膜的结构和功能会被累积过量的活性氧给破坏[16]，而POD、CAT是清除活性氧主要酶。由图5可知，处理组POD、CAT的活性均比对照组高。CAT的活性随着胁迫温度的降低呈先增加而后降低的趋势，7 ℃时达到最高。在13 ℃时，2组CAT活性相差不大，而在7 ℃时，处理组的CAT活性比对照组高11.72%。POD活性随着温度的下降呈逐渐上升的趋势，在各个低温胁迫时，处理组的POD活性比对照组高。在7 ℃时，对照组POD含量为467.13 U/（min·g），对照组为734.6 U/（min·g）。在4 ℃时POD活性最高，处理组是对照组的2.03倍。表明EMS诱变经HYP筛选后得到的诱变植株清除活性氧的能力比对照株强，说明EMS诱变经HYP筛选后得到的诱变植株具有较强的抗寒力。
2.5.2 不同低温胁迫对MDA、脯氨酸含量的影响。
MDA是植物遭受氧化损伤时产生的膜脂质过氧化产物，反映膜受损的程度，可作为抗寒能力的指标[17]。由图6可知，MDA含量随着胁迫温度的降低而逐渐增加，处理组MDA的含量始终低于对照组，在4 ℃时MDA含量最高，处理组为199.14 μg/g，对照组为148.63 μg/g。说明EMS诱变筛选后的诱变株细胞膜的受损程度比对照组小。
脯氨酸是植物重要的渗透调节物质。在逆境条件下，植物中脯氨酸含量会明显增加，其含量的增加量在一定程度上反映了植物的抗逆性。因此。脯氨酸的增加量可作为抗逆育种的生理指标之一。由图6可知，随着温度的下降，脯氨酸的含量呈逐渐上升的趋势，处理组脯氨酸含量明显高于对照组，处理组在4 ℃时脯氨酸含量最高，为3.043 μg/g，明显高于对照组的1.51 μg/g。说明在低温胁迫下，EMS诱变筛选后的“巴西蕉”诱变株可以提高脯氨酸的积累量，抗逆能力比对照株强。
3 结论与讨论
香蕉是典型的热带亚热带果树，喜高温怕低温，低温是香蕉生产中的主要限制性因素之一。因此选育香蕉抗寒品种是解决香蕉寒害问题的根本出路。目前香蕉新品种选育方法有杂交育种、现代生物技术育种和诱变育种等。而大部分栽培品种香蕉是多倍体，具有亲本高度不育的特点，因此通过传统杂交育种方式培育和改良香蕉品种相对比较困难且育种周期较长。另外现代分子育种虽具有快速、准确、不受环境干扰的特点，但技术要求较高且操作程序复杂，并在一些国家受制于法律约束。而诱变育种可在较短时间内获得有价值的突变体，且具有操作简单、成本低、诱变后代易稳定遗传、突变范围广的特点。该试验采用“巴西蕉”无菌增殖芽作为外植體，利用不同浓度的EMS诱变剂和诱变时间诱导变异，诱变后的外植体经过不同浓度的L-HYP定向筛选，可获得抗寒突变体。 3.1 EMS诱变适宜条件的确定
以经一定浓度诱变剂及时间处理的材料的半致死率作为筛选标准，是为了获得较高的突变率及保证有一定数量的诱变材料。因此，选择诱变浓度和时间极为重要，但不同的处理材料，其适宜的诱变浓度和处理时间也不同。尚静等[18]研究EMS诱变茄子种子时，确定了0.5%EMS处理6 h和1.0%EMS处理4 h为半致死量，其致死率均接近50%。齐晓花等[19]研究EMS诱变构建黄瓜突变体库时，确定了黄瓜“YZ-01”的半致死量为1.5%。刘艳萌等[20]研究发现EMS溶液处理草莓离体叶片适宜处理条件为0.2%+2.0 h和0.4%+1.0 h，EMS诱变愈伤组织的适宜条件为0.1%+1.5 h和0.2%+1.0 h。孙慧[10]利用1.5%EMS+4 h对海滨木槿种子进行诱变，获得了抗寒性较强的新品系。该试验中，2.0%的EMS处理4 h时，其无菌增殖芽达到完全褐化死亡状态，可能是由于EMS浓度过高和时间过长导致诱变剂对无菌增殖芽的毒害作用过强。当EMS的诱变条件为1.5%EMS+3 h和1.0%EMS+4 h，无菌增殖芽的致死率分别为45.37%和46.97%，虽两者都不是半致死剂量，但致死率均接近半致死率。祁伟[2]研究表明，诱变剂浓度比处理时间的影响大，使用高浓度的诱变剂获得变异突变体概率大。同时考虑分化率因素，该试验确定EMS诱变“巴西蕉”无菌增殖芽的适宜条件为1.5%EMS+3 h，为后期选育优良的香蕉品种提供材料。同时为EMS诱变“巴西蕉”无菌增殖芽提供参考。
3.2 HYP对无菌苗成活的影响
L-HYP定向筛选香蕉无菌苗的文献尚未见报道。L-HYP是脯氨酸类似物，HYP是脯氨酸的类似物，它可以与脯氨酸竞争，反馈和抑制脯氨酸合成过程中的谷氨酸激酶，对植物组织造成损害，植物组织需要产生大量的脯氨酸来降低HYP的比例才能生存。因此
研究区农业用地适宜用地主要集中在中部，其余分布于南部，西北部和东部少。一般适宜用地仍主要集中在中部，其余分布于南部，西北部和东部少。较不适宜用地呈零散状分布于适宜用地和一般适宜用地的边缘。不适宜用地主要集中于东部和西部。禁止用地面积主要集中在西南部，东部次之，最南部和最北部分布较少。
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