目的对一个多指(趾)小家系的患者进行候选致病基因筛查,并用minigene方法对可能致病突变进行体外实验验证。方法该家系包含2名患者,患者1为男性,双手轴后多指,左足轴前多趾,右足正常;患者2为患者1女儿,其双手轴后多指,双足轴前多趾且2-3趾并趾。获得知情同意后,采集患者1外周血6ml,采用蛋白酶K-SDS-酚/氯仿法提取基因组DNA;针对GLI3基因和HOXD13基因的外显子及外显子/内含子的交界区设计引物,进行PCR扩增和测序;针对在患者1GLI3基因中发现的碱基改变,通过PCR和限制性酶切技术对患者及145名正常对照个体进行突变验证。随后采用minigene方法,将包含可能致病突变的GLI3基因第10内含子5’及3’端各1.4kb序列连同两端第10、11外显子全长序列克隆至pcDNA3.1载体,同时构建野生型质粒作为正常对照,将二种构建体转染HeLa细胞24小时后提取细胞RNA,使用分别位于第10和第11外显子的引物进行RT-PCR扩增,通过中性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较不同转染产物扩增片段的大小并对片段进行测序。结果基因组DNA测序结果表明,患者1存在GLI3基因c.1540+2insT突变,该突变国际上未见报道。限制性酶切结果表明此突变仅存在于患者中,而未见于145名正常对照个体。中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示突变型所得的RT-PCR产物为两种长度不同的片段,分别较野生型所得的RT-PCR产物片段延长约10bp和60bp。测序结果显示突变型GLI3 minigene无法识别第10内含子原有5’剪接供体位点,新产生的2种剪接供体位点较野生型分别后移了12bp和58bp。结论多指(趾)患者1的GLI3基因c.1540+2insT突变可能导致剪接位点的改变,进而使其编码肽链延长和(或)移码,因此初步推测此突变是该多指(趾)小家系的致病突变。