在复杂的生命体系中,对生物分子进行检测与实时监控对于疾病的早期诊断有着重要的意义。因此研究人员开发了一系列的检测手段。基于有机小分子荧光染料而发展的荧光成像技术具有灵敏度高、选择性好、对样品伤害小等优点,研究人员将其广泛应用于对细胞、组织中各种生命分子的检测与成像。然而传统的荧光染料分子大多为单光子激发,激发波长比较短。这使其有一系列的缺点:如光漂白现象比较严重、信号组织穿透深度比较浅和细胞及组织的自身荧光干扰等。这些缺点限制了传统探针在生命体系中的应用。基于双光子荧光染料发展的双光子荧光成像技术,由于使用了能量低、波长长的激光脉冲作为激发光,可以很好的克服单光子荧光探针的上述缺点;同时在成像时可以提供更好空间分辨率,降低了激发光对样本的损伤,因此更适用于在复杂的生命体系应用。本论文基于双光子荧光染料设计合成了一系列的双光子荧光探针,并进一步将探针应用于复杂的生命体系中对生命分子进行检测:在第2章中,基于硝基还原酶在缺氧条件下对硝基特异性识别与还原作用,我们通过在萘衍生物上引入对硝基苄基基团,设计合成了增强型双光子荧光探针P-NTR用于检测细胞的硝基还原酶的活性,并取得了良好的效果。硝基基团通过PET作用,淬灭荧光基团的荧光信号;而在缺氧条件下,硝基还原酶可以特异性还原探针P-NTR的硝基基团,释放出荧光染料,荧光恢复。探针P-NTR对硝基还原酶选择性,灵敏度高,线性检测范围为0.05-0.9μg/mL,检测限为20ng/mL。同时我们将探针P-NTR进一步应用于缺氧条件下组织中的硝基还原酶的检测与成像。在第3章中,基于多硫化合物对2-氟-4-硝基苯甲酸酯的特异性反应,我们通过在双光子荧光染料上引入2-氟-4-硝基苯甲酸,设计合成了比例型双光子荧光探针TPR-S,用于在生命体系中对多硫化合物的检测与成像。多硫化合物与探针中的2-氟-4-硝基苯甲酸酯基团反应,并释放出荧光染料,使得448 nm处的荧光信号强度降低,541 nm处荧光强度上升,实现了对多硫化合物的比例型检测。探针TPR-S对多硫化合物的选择性好,灵敏度较高,线性检测范围为1-16 μM,检测限为0.7 μM,适用于复杂的生命体系中对多硫化合物的检测与成像。我们进一步将探针TPR-S应用于败血症引起的内脏损伤样本中多硫化合物的检测与成像,并有满意的结果。在第4章中,我们基于谷胱甘肽S-转移酶催化谷胱甘肽,与缺电子基团反应机理,以萘衍生物作为荧光基团,通过引入2,4-二硝基苯磺酸酯基团设计合成了增强型双光子荧光探针P-GST,用于在生命体系中对谷胱甘肽S-转移酶活性的检测与成像。2,4-二硝基苯磺酸酯基团可以通过PET过程淬灭荧光基团的荧光信号,而谷胱甘肽在谷胱甘肽S-转移酶催化下与2,4-二硝基苯磺酸酯基团反应,释放出荧光基团,引起荧光信号增强。探针P-GST对谷胱甘肽S-转移酶的灵敏度高,选择性好,线性检测范围为0.04-0.5 μg/mL,检测限为35 ng/mL。我们进一步将探针P-GST也应用于药物诱导的肝损伤样本中谷肮甘肽S-转移酶活性的检测,并取得了满意的效果。在第5章中,我们基于钯离子催化丙炔基机理,通过在2-(2-羟苯基)-4-(3氢)-喹啉酮(HPQ)上引入丙炔基团,设计合成了增强型双光子荧光探针P-Pd用于检测细胞与组织中的钯离子。钯离子催化丙炔基团脱落,释放出荧光基团,荧光信号增强。探针P-Pd对钯离子的线性检测范围为1.5-48 μM,检测限为0.65μM。探针P-Pd也在细胞和组织内对钯离子进行了检测与成像,取得了令人满意的结果。