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目的:在畜禽养殖中,饲养员为了避免畜禽因病死亡而造成损失,在饲料中过度的添加抗生素,使畜禽提高其抵抗力,从而少生病。但含有抗生素残留的畜禽被人们食用后,抗生素在人体内不断蓄积会造成各种人体伤害,如儿童骨骼发育受到影响,产生严重过敏性反应、肾损害,甚至产生耐药菌。为了避免畜禽养殖中抗生素过度使用现象的产生,将中药作为饲料添加剂应用也是一种重要的预防措施。寻找中药中安全、有效、副作用小的“天然组合化合物”作为饲料添加剂,可以有效提高畜禽免疫功能,预防炎症疾病、细菌感染性疾病,从而能够减少抗生素的使用。杜仲叶（Eucommiae Folium,EF）及刺五加（Acanthopanax Senticosus,AS）同是补益肝肾、强健筋骨之品,也均能降低血压,镇静,调节免疫,增强抵抗力。中药成分的提取与其工艺的研究密不可分。基于项目研究所对湿法超微粉碎提取（Wet ultra-micro pulverization extraction,WUPE）及膜耦合纯化（本文采用的是微滤膜澄清（Clarification by microfiltration membrane,CMM）,CMM属于膜耦合纯化的一种。）的研究,以及EF、AS畜禽养殖应用的基础上,本论文用细胞活力及细胞培养液中炎性物质的表达筛选提取工艺,并将最佳工艺下的提取液进行免疫、抗炎及抑菌作用研究。此外,将利用网络药理学（Network Pharmacology,NP）方法预测EF、AS与肠道疾病的作用相关靶点及通路,以期为中药畜禽养殖应用提供新的研究方向及思路。方法:（1）通过免疫抗炎作用指导筛选EF-AS提取液的制备工艺,筛选条件包括EF与AS的药物比例、提取方法、提取时间以及0.2μm CMM前后。一是将各个条件下的提取液作用于RAW264.7细胞,观察是否存在增殖作用;二是利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）建立炎症模型,盐酸L-NAMC（L-NAMC hydrochloride,L-NAMC）为阳性药组,EF-AS给药预保护1 h后再和LPS共孵育24 h,进行RAW264.7细胞的活力检测和细胞培养液中炎性物质的检测。（2）研究WUPE和CMM制备的EF-AS提取液对RAW264.7细胞的抗炎免疫活性作用。实验首先筛选该制备方法下EF-AS提取液的高中低浓度。未进行炎症造模前,分为正常组,EF-AS 10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml剂量组;在炎症模型中分为正常组,LPS组、EF-AS 10μg/ml+LPS、1μg/ml+LPS、0.1μg/ml+LPS剂量组,L-NAMC+LPS组。一是考察EF-AS提取液对RAW264.7细胞的增殖、吞噬作用,并分析培养液中含一氧化氮（Nitric Oxide,NO）的情况;二是在细胞炎性模型中,通过试剂盒对细胞上清中炎性物质NO、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、白细胞介素1β（nterleukin-1β,IL-1β）、白细胞介素6（IInterleukin-6,IL-6）,以及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、活化氧（Reactive oxygen species,ROS）、髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的检测,反应其免疫抗炎作用。（3）探究EF-AS提取液以WUPE和CMM制备后对促炎型M1样、抗炎型M2样巨噬细胞的调节作用。采用10 ng/ml LPS极化48 h为M1样巨噬细胞,10 ng/ml白细胞介素10（Interleukin-10,IL-10）极化48 h为M2样巨噬细胞。观察EF-AS提取液作用于极化的M1样、M2样细胞后,对它们增殖作用、吞噬作用以及两种极化细胞表型标志物的影响。（4）EF-AS提取液对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus,SA）的抗菌作用。采用纸片法测定不同处理方法下的EF-AS提取液的抑菌作用;利用试管二倍稀释法进行EF-AS提取液的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration,MIC）的测定。（5）利用NP方法预测EF-AS治疗肠道疾病的炎症相关靶点及机制。EF活性成分及其作用靶点是通过搜索中药系统药理学（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP）数据库获得,AS活性成分是结合BATMAN、化学专业数据库以及Swiss ADME数据库分析而得,随之将AS所得活性成分在Swiss Target Prediction数据库搜索其作用靶点。肠道疾病基因结合Gene Cards与OMIM两个数据库分析,并筛选其与EF、AS活性成分的共同作用靶点。将获得的共同靶点上传至String数据库进行蛋白质相互关系网络（Protein-protein interaction,PPI）分析,构建PPI网络,预测关键靶点蛋白。选择Cytoscape3.7.1软件完成“EF-AS-活性成分-作用靶点-肠道疾病”网络图,随之分析GO功能与KEGG通路富集情况,预测EF-AS治疗肠道疾病的作用机制。结果:（1）通过免疫抗炎作用指导筛选EF-AS提取液的制备工艺。实验结果可知,（1）与正常组比较,0.5μg/ml、1μg/ml和2μg/ml的LPS均可对RAW264.7细胞造成损伤,其LPS为1μg/ml时,RAW264.7细胞存活率为50%左右。（2）EF和AS药物比例为3:2时,对RAW264.7细胞有增殖作用;与模型组比较,对LPS刺激的RAW264.7细胞炎性模型有明显的保护作用,且显著优于比例为3:4和3:8的组别,同时明显减少炎性物质NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。（3）采用WUPE提取的EF-AS提取液较加热提取（Heated extraction,HE）有更明显的药效作用。（4）同种提取方法下,提取10 min与提取5 min对细胞既无毒性作用也无显著的增殖作用,而在炎症模型中,提取10 min较提取5 min具有极显著差异,且在每一个炎性物质的检测中均能降低表达。（5）CMM后的EF-AS提取液对RAW264.7细胞调节作用优于澄清前。因而后续研究中EF-AS提取液以药物比3:2,WUPE提取10 min,0.2μm CMM制备。（2）研究WUPE和CMM制备的EF-AS提取液对RAW264.7细胞的抗炎免疫活性作用。实验结果显示:（1）浓度为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml的EF-AS提取液均可使RAW264.7细胞增殖,我们将10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml设定为高中低剂量组。（2）EF-AS提取液免疫调节表现于RAW264.7细胞的增殖作用、吞噬作用的增加,同时不会增加NO的表达。（3）EF-AS能增加RAW264.7细胞炎性模型的细胞活力、吞噬能力以及GSH含量,显著降低炎性物质NO、TNF-α、IL-1β、IL-6,显著降低LDH、MPO、ROS的含量。（3）探究EF-AS提取液以WUPE和CMM制备后对促炎型M1样、抗炎型M2样巨噬细胞的调节作用。实验结果:EF-AS提取液可以降低M1样巨噬细胞存活率,而M2样细胞不受影响;EF-AS提取液能影响标志物i NOS在M1样细胞降低,标志物Arginase在M2样细胞增加;EF-AS提取液不仅增加M1样细胞吞噬作用,对M2样巨噬细胞也有同样的作用趋势。（4）EF-AS提取液对SA的抗菌作用。实验结果:EF-AS提取液以WUPE和CMM制备后,SA的生长受到限制,呈中度反应。MIC结果为0.0912 mg/ml。（5）利用NP方法预测EF-AS治疗肠道疾病的炎症相关靶点及机制。EF有效活性成分3个,AS活性成分20个,EF、AS有效成分对应靶基因495个,肠道疾病相关靶点1951个,药物与疾病共有靶点225个。GO分析得到2597条基因功能,KEGG通路富集分析确定了165条相关通路,总结EF-AS可能通过人类巨细胞病毒感染、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等进行肠道疾病治疗。结论:WUPE和CMM与传统加热过滤方法比较,前者制备得到的EF-AS提取液较传统加热过滤方法能更有效提高RAW264.7细胞的免疫抗炎作用,中度抑制SA的生长,其作用原理可能与EF-AS提取液对RAW264.7细胞吞噬能力的提高、降低炎性物质和氧化物的表达等相关,说明WUPE和CMM可能更有利于提取分离EF、AS中免疫抗炎及抗菌的成分。NP预测EF-AS治疗肠道疾病相关靶点及机制,发现EF、AS可能通过AKT1、TP53等多个靶点调节TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等多个通路改善肠道疾病的炎性情况,与细胞实验结果有相同的作用通路。因此,EF和AS可被发展用于动物饲料添加剂,以减少抗生素使用。