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前言埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白（Ezrin-Radixin-Moesin,ERM）蛋白家族通过组成膜细胞骨架相关复合体和特殊膜结构对细胞活动进行调节,在肿瘤的侵袭转移中起了重要的作用。细胞骨架连接蛋白ezrin属于ERM家族成员之一,定位于6q25.2-6q26编码基因为villin2。新近研究发现ezrin高表达与多种恶性肿瘤的侵袭转移呈正相关。细胞内ezrin通过N端与C端相互作用,形成头尾连接的折叠状态遮蔽了分子表面的结合位点,处于失活状态。Fievet等发现Thr567磷酸化和PIP2共同参与ezrin活化,活化的ezrin通过连接F-肌动蛋白丝与胞膜的CD44,E-钙黏附蛋白（E-cadherin）,细胞间黏附分子1/2（Intercellular adhesion molecule1/2,ICAM1/2）等发挥功能。探讨ezrin上下游调控分子,这些与调控有关的分子将会成为治疗肿瘤转移的关键。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK）是细胞的主要信号传导系统之一,p38MAPK属于MAPK的一个亚族,它通过磷酸化作用改变下游因子的表达,参与多种胞内信息传递过程。多种生长因子、炎症因子和应激反应可激活p38MAPK,p38MAPK激活后可使多种转录因子活化,影响基因转录、蛋白合成,细胞能动性和细胞骨架结构改变,在细胞侵袭、转移方面具有重要的调控功能。综上p38和ezrin只有都磷酸化后才能行使后续功能,目前关于p-p38,p-ezrin两者在介导乳腺癌转移方面的研究,国内外鲜有报道。Mengdong Lan等研究发现小鼠永生性肝细胞系中ezrin蛋白通p38MAPK信号通路的磷酸化参与微绒毛的形成,这说明p38与ezrin可能存在着一定的联系,但是作者认为:1:转染raf-1基因的小鼠肝细胞中snail表达上调E-caherin,ezrin表达下调,微绒毛缩短,小鼠肝细胞发生上皮间质转,细胞间黏附变弱而易发生转移。2:加入p38抑制剂SB203580后,ezrin,p-ezrin,E-cadherin表达上调,微绒毛变长变粗,而snail表达下调,不易发生转移。然而我们认为:p38MAPK信号通路可能参与ezrin C端（Thr567）的磷酸化,使p-ezrin上调,微绒毛变长变粗,从而增强肿瘤的侵袭转移能力。为此本实验在回顾乳腺癌中p-ezrin和p-p38表达的基础上,着重研究两者在乳腺癌细胞系中的关系。探讨p38MAPK通路是否参与ezrin C端（Thr567）的磷酸化,影响p-ezrin蛋白表达,微绒毛的形成。为乳腺癌复发转移的治疗提供新的理论依据。材料和方法1、材料（1）临床资料80例乳腺癌组织,取自于中国医科大学附属第一医院2001年1月至2007年5月手术切除标本。所有患者术前未经任何治疗。80例均为乳腺浸润性导管癌（IDC）,TNM分期Ⅰ-Ⅱ期51例,Ⅲ-Ⅳ期29例。有淋巴结转移33例;收集50例外科手术切除新鲜乳腺组织标本,标本取出后立即置-70℃冰冻保存。其中30例为IDC,有淋巴结转移为13例,20例为乳腺纤维腺瘤。（2）细胞系三种人乳腺细胞系（MCF-10A为乳腺正常上皮细胞系,MCF-7为低侵袭低转移癌细胞系,MDA-MB-435s为高侵袭高转移癌细胞系）原购自北京协和基础医学院细胞中心,本实验由中国医科大学已有的细胞复苏而得。（3）主要试剂抗人p-p38单克隆抗体（#9216）和兔抗人p-ezrin单克隆抗体（#3149）购自Cell signaling公司。p38MAPK特异性抑制剂SB203580（#559398）购自美国Calbiochem公司,于-20℃保存待用。异硫氰四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽（TRITC-Phalloidin）购自Sigma公司,Transwell小室（孔径8um）购自Corning公司。2、方法（1）免疫组织化学技术80例标本经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法（Streptavidin-peroxidase,S-P）按说明书行免疫组化染色。p-p38稀释比例为1∶200,p-ezrin稀释比例为1∶50;以PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照。（2）Western blot技术总蛋白从组织、生长到对数期收集的细胞及不同浓度的SB203580（0、5、10、20umol/L）处理24小时后的435s细胞中提取。用Bradford法测定蛋白浓度。取等量蛋白,进行SDS-PAGE和转印,分别孵育一抗（p-p38 1∶400,p-ezrin1∶400稀释）4℃过夜,相应二抗（1∶4000）37℃孵育,ECL发光,拍照。用表达p-p38的PVDF膜剥脱后重新孵育获得β-actin抗体作为内参。（3）细胞免疫荧光染色取对数生长435s细胞,接种到24孔板中,4%多聚甲醛固定30min,1%TritonX-100增加细胞膜的通透性,BSA封闭后,分别加入一抗p-p38（1∶100）,p-ezrin（1∶100）,4℃过夜,避光加入相应FITC标记二抗（1∶50）,同时加入异硫氰四甲基罗丹明（TRITC）标记的鬼笔环肽（1∶50）,30分钟后,避光加入Hoechest（1∶100）37℃复染细胞核。荧光显微镜（BX60,OLYMPUS）观察成像。（4）扫描电镜取对数生长细胞,消化后接种到盖玻片上,用不同浓度的SB203580（0、5、10、20umol/L）处理435s,24小时后,加2%戊二醛+2%甲醛固定24小时,1%锇酸固定1.5小时,梯度酒精脱水,醋酸异戊酯置换,CO2临界点干燥,真金喷镀,扫描电镜（日本JEOL SEM-T300）观察并摄片。（5）Transwell上室加入1∶6Matrigel胶制成的人工基底膜后接种总体积200ul435s细胞,并加入终浓度分别为0、5、10、20umol/LSB203580。每个药物浓度做3复孔,37℃培养24h后观察。擦掉基底膜上室面的细胞,下室细胞固定后Giemsa染色。400×光镜下随机选择30个视野计数,取其平均数为穿膜细胞数。3、统计学分析应用SPSS13.0统计软件行数据处理:采用χ2检验（不满条件时用Fisher确切概率法）分析各组计数资料,采用Spearman等级相关分析p-p38蛋白与p-ezrin蛋白表达的关系,采用t检验分析Western blot图像灰度值,transwell穿膜细胞数,用LSD-t检验对各样本均数行两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、p-p38、p-ezrin在乳腺癌组织中的表达及其同临床病理关系（1）免疫组化结果显示:p-p38在80例IDC组织中阳性表达49例（61.3%）,主要定位于细胞核,少量定位于细胞浆。p-ezrin阳性表达34例（42.5%）,定位于细胞膜,少量定位于细胞浆。统计学分析显示,p-p38蛋白表达和p-ezrin蛋白表达呈正相关（r=0.269,P=0.016）。两者表达水平均与IDC的TNM分期（P=0.012,P=0.002）、淋巴结转移情况（P=0.015,P=0.001）相关,而与患者年龄（P=0.580,P=0.670）,肿瘤大小（P=0.107,P=0.142）无明显相关性。（2）Western blot结果显示:参照DNA分子量标准,可见在43,80KD附近有特异性条带,对应位置分别为p-p38,p-EzrinThr（567）/Radixin（Thr564）,统计结果显示:p-p38,p-ezrin在IDC中的表达高于乳腺纤维腺瘤组（P=0.015,P=0.000）,两者的表达水平在Ⅲ—Ⅳ期IDC中高于Ⅰ—Ⅱ期（P=0.023,P=0.000）;在有淋巴结转移的乳腺癌中高于无淋巴结转移患者（P=0.028,P=0.002）;而与患者的年龄、肿瘤大小无明显相关性（P=0.7881,P=0.773;P=0.739,P=0.895）。2、p-p38、p-ezrin在乳腺细胞系中的表达（1）Western blot检测,乳腺正常上皮细胞系10A和乳腺癌细胞系MCF-7,435s中两种蛋白表达水平呈递增趋势。（2）选取两种蛋白均高表达的高侵袭高转移435s细胞系,荧光定位显示:p-p38在胞核中强表达,在胞浆中仅有少量的表达;p-ezrin在胞浆和胞膜上弥散表达,均显示绿色荧光;F-actin在胞浆和胞膜上表达,呈红色,双色荧光分析显示p-ezrin和F-actin在同一细胞内共位表达。3、p38MAPK信号通路特异性阻断剂SB203580作用MDA-MB-435s细胞系24h后观察各指标改变SB203580可以浓度依赖性地下调435s细胞系中p-ezrin蛋白表达水平,而不影响p-p38蛋白表达;使细胞微绒毛变短,数量减少,甚至消失;并能抑制乳腺癌细胞的侵袭转移潜能（P均＜0.05）。结论1、p-p38、p-ezrin过表达与IDC的TMN分期、淋巴结转移有关,p38MAPK信号通路在乳腺癌侵袭转移中起重要作用。2、p-ezrin可能通过p38MAPK通路介导乳腺癌转移。