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新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一类禽类呼吸道疾病,感染宿主高度致死,因此对中国乃至全球的家禽业造成巨大的威胁,至今仍无特异性治疗药物。单链抗体(scFv)是免疫球蛋白最小的功能性结构单元,具有抗原结合活性,且在脊椎动物与非脊椎动物中均能表达。单链抗体除了应用于医学诊断与治疗,还具有中和病毒的能力。本研究探索利用PiggyBac转座子系统构建抗新城疫病毒单链抗体真核表达载体,分别为pB315B-CAG-puro-pGFP-scFv、pB315B-EF1α-puro-pGFP-scFv。通过脂质体LipofectamineTM2000将构建的两个重组质粒分别转染DF-1细胞和293T细胞,获得了稳定转染抗新城疫病毒单链抗体的DF-1-CAG-scFv、 293T-CAG-scFv、DF-1-EF1α-scFv与293T-EF1α-scFv等4种细胞系。PiggyBac转座子系统在DF-1和293T细胞中的转座效率分别为19.1%和25.8%。RT-PCR结果表明,抗新城疫病毒单链抗体基因在4种细胞中均检测到mRNA。通过western blot检测与抗新城疫病毒单链抗体融合的His标签蛋白来确定其在各细胞系中的表达情况,结果表明,在上述4种转染细胞的裂解液中均没有检测到His标签蛋白,然而在DF-1-EF1α-scFv和DF-1-CAG-scFv细胞上清中有scFv表达,前者含量高于后者。利用6倍、60倍、600倍TCID50的新城疫病毒分别感染DF-1、DF-1-CAG-scFv和DF-1-EF1α-scFv细胞。结果表明,当新城疫病毒量为60TCID50与600TCID50时,DF-1与DF-1-CAG-scFv细胞发生病变的孔数明显多于DF-1-EF1α-scFv。本实验表明,EF1α启动子对单链抗体的表达翻译效果更好,利用该启动子构建的新城疫病毒单链抗体能够在DF-1细胞中稳定表达,并分泌到细胞外,具有良好的抗新城疫病毒效果。将以EF1α为启动子的抗新城疫病毒单链抗体质粒转染鸡原始生殖细胞(PGCs),24 h后的转染效率为2.9%,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达抗新城疫病毒单链抗体的PGCs细胞系。本研究为抗新城疫病毒单链抗体的转基因鸡的生产奠定了基础。