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胰蛋白酶抑制剂广泛存在于动、植物和微生物中,泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的多肽或者蛋白质,能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡,调节生命体内许多重要的生命活动。研究表明大豆中至少含有5种胰蛋白酶抑制剂,但目前其中只有库尼兹(Kunitz,KTI)、包曼-伯克(Bowman-Birk,BBI)两种类型抑制剂被分离。对粗BBI的提取研究。首先采用乙醇对BBI进行进取,通过单因素实验确定了比较适宜的乙醇提取条件,包括乙醇浓度40%～80%、液料比(乙醇质量g/干燥脱脂大豆粉质量g)4～6、提取时间30～60min和提取温度30～60℃。然后利用正交试验得出最佳的乙醇提取条件为:乙醇浓度65%,液料比(乙醇质量g/干燥脱脂大豆粉质量g)为5,提取时间60nin,提取温度60℃。乙醇提取后,又采用等电点法,调pH值,Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的等电点为4.2,使胰蛋白酶抑制剂在等电点时达到最大沉淀,然后加入丙酮,沉淀溶液中的胰蛋白酶抑制剂。并做单因素实验得出最佳丙酮用量为(丙酮质量g/调pH值后溶液质量g=2)。再进行超滤,选出超滤的各项参数。包括超滤压力60kPa,超滤温度35℃。最后进行真空干燥得出粗BBI晶体。根据Bradford法按最佳乙醇提取条件和最佳丙酮用量以及上述超滤条件测得BBI粗晶体得率为6.1mg/g。根据BAPNA法以Sigma公司BBI为标准品测得BBI粗晶体中BBI的含量为93.7%。对粗BBI纯化的研究。本实验采用DEAE-25离子交换层析和Sephadex G-50凝胶柱过滤,得出的纯品,根据BAPNA法以Sigma公司BBI为标准品测得实验所得纯品纯度为99.8%。采用BAPNA法测定BBI抑制活性,得出BBI的量与吸光度变化值之间的正比变化关系。本课题还对BBI的稳定性做了实验,分别改变影响BBI抑制活性的条件.以得到BBI稳定性方面的数据。对BBI抑制活性影响的因素有温度、pH值、还原剂。分别在不同的温度下处理BBI,同时采用BAPNA法测定BBI抑制胰蛋白酶吸光度变化值。得出BBI的热稳定性。配制不同pH值的缓冲液处理BBI, pH3.0,采用1.0mol/L的甘氨酸-HCl缓冲液;pH4.0~6.0,采用0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH7.0,采用0.1mol/L磷酸二氢钠-磷酸二钠盐缓冲液;pH8.0~9.0采用0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液;pH10.0~12.0采用0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,处理12h观察其抑制活性的变化,然后用pH8.0的缓冲液处理12小时,再观察其抑制活性的变化。pH值的变化对BBI的抑制活性的抑制是可逆的。又通过实验还原剂DTT对BBI的抑制活性的影响得出BBI对还原剂也有很强的稳定性。本实验也对BBI的失活进行了研究。采用超声波法。超声频率为100kHz,在不同的超声时间处理下,测定BBI抑制活性。发现在100kHz的超声处理3min,BBI完全失活。