论文部分内容阅读
研究背景胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是一种起源于胆道上皮的的恶性肿瘤。根据2017年第八版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)和国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control,UICC)的分类标准,将胆管癌按发病部位分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝外胆管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma,EHCC),其中肝外胆管癌又分为肝门部胆管癌(perihilar cholangiocarcinoma,PHCC)和远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma,DCC)。这对于胆管癌的研究有这非常重要的意义,因为每一种类型的胆管癌有其独特的流行病学特征、生物学行为、诊断和治疗方法。其中PHCC是最常见的一种类型,约占所有胆管癌的50%-70%,而ICC和DCC分别约占 20%-3 0%和 10%。根治性手术是胆管癌的主要治疗方式,但ICC和EHCC的根治性手术都十分困难。对于ICC患者需要行肝脏切除;DCC通常需要行胆管部分切除或者是胰十二指肠切除;而PHCC由于其独特的解剖位置,肝门部胆管和血管之间复杂、密切、多变的关系,使得其根治性手术更加的复杂和更大的技术挑战性。同时,由于胆管癌患者早期症状不明显,大多数患者一经诊断就失去了手术根治的机会。加之胆管癌对放疗和化疗不敏感,即使胆管癌患者行根治性手术,术后5年总生存率(overall survival,OS)仍不足30%。与ICC相比,EHCC在临床研究,靶向药物研究,肿瘤标志物研究等方面的研究更少。膜联蛋白家族(Annexins)是钙离子依赖的磷脂结合蛋白,在生物膜的形成、调节细胞的增殖分化等生理过程中起着十分重要的作用。同时,Annexins家族在肿瘤的发生发展过程中也扮演着重要的角色。例如:ANXA1与胰腺癌、食管癌的发生密切相关;ANXA2的高表达与胃癌、结直肠癌、乳腺癌等密切相关。其中ANXA10是Annexins家族中的新成员,据报道,ANXA10在人的各组织中表达不均衡,在肝和胃中表达量高,在胰腺中少量表达,而在脾脏、乳腺、肺等组织中几乎不表达。ANXA10目前在肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、膀胱癌中研究中比较多见,而在胆管癌中的研究尚未见报道。研究目的:1.通过分析5对PHCC患者的癌组织及其对应的癌旁组织的转录组测序,在Annexins家族中筛选出有意义的肿瘤标志物,为CCA的治疗提供新的思路。2.利用CCA患者的新鲜组织,通过qRT-PCR和western blot,进一步明确ANXA10在不同部位CCA中的表达情况。3.通过对CCA患者组织芯片(tissue microarray TMA)的免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC),结合患者的术后随访,明确 ANXA10与CCA临床病理特征的关系,及对CCA患者预后的影响。研究方法:1.收集经病理诊断的5对PHCC患者的癌组织及其对应的癌旁组织,委托公司行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),分析测序结果,找出Annexins家族中最有统计学意义的分子。2.分别收集20对ICC,PHCC和DCC患者的癌组织及癌旁组织,通过qRT-PCR和western blot进一步明确ANXA10在癌组织和癌旁组织中的表达差异,比较ANXA10在不同部位胆管癌中的表达情况。3.收集山东大学齐鲁医院自2012年1月至2018年12月接受胆管癌根治性手术患者的石蜡组织标本共计303例(其中ICC91例,PHCC128例,DCC84例)。制作组织芯片,并行IHC染色,验证ANXA10在组织芯片中的表达情况并评分。4.根据 ANXA10 的组化评分,利用 ROC 曲线(receiver operating characteristic curve)分别计算得到ICC,PHCC和DCC的cut-off值,进而将其患者分为低表达组和高表达组。通过卡方检验(Chi-square test)或Fisher检验分析,分别获得ANXA10与各部位胆管癌临床病理特征之间的关系。5.通过电话随访了解患者的术后生存情况,通过Kaplan-Meier法进行单因素生存分析,明确胆管癌临床病理特征及ANXA10对患者预后的影响。通过Cox回归模型进行多因素分析,明确ANXA10是否是影响胆管癌预后的独立危险因素。研究结果:1.通过分析转录组测序结果,我们发现在Annexins家族12个分子中,ANXA10变化最明显,即在癌组织中表达升高,提示ANXA10在CCA中具有促癌作用。2.qRT-PCR结果证明ANXA10在EHCC癌组织中表达显著升高(p<0.001),而在ICC中无统计学差异(p>0.05)。western blot结果进一步证明ANXA10在EHCC癌组织中表达升高。3.利用免疫组化的染色强度乘以染色面积计算ANXA10的IHC评分,ANXA10在不同部位的胆管癌组织中均表达,但在PHCC中表达最高(p<0.05),其次是DCC(p<0.01),而在ICC中表达最低。4.ROC曲线计算得到ICC,PHCC和DCC的cut-off分别为5、5、5。在PHCC中,ANXA10的高表达与肿瘤的低分化有关(p=0.001);在DCC中,ANXA10的高表达与肿瘤的低分化(P<0.001)和TNM分期(p=0.049)有关;而在ICC中,ANXA10的高表达在年龄、性别、肿瘤大小、分化、TNM分期等方面无统计学差异(p>0.05)。5.单因素分析结果显示ANXA10的高表达与PHCC(p<0.001)和DCC(p<0.001)的不良预后相关,而与ICC患者的预后无明显关系(p=0.311)。除TNM分期外,将单因素分析中p<0.2的预后因素均纳入Cox回归模型进行多变量分析,ANXA 10被鉴定为影响PHCC(p=0.026)和DCC(p=0.002)患者预后的独立危险因素。结论:1.ANXA10在EHCC患者的癌组织及癌旁组织中存在表达差异,即在癌组织中表达升高,而在ICC中无明显差异。2.在PHCC和DCC中,ANXA10的表达均与肿瘤的分化有关,即ANXA10的表达高,EHCC的肿瘤分化程度低。3.ANXA10的高表达与PHCC和DCC的不良预后相关,且为影响EHCC患者预后的独立危险因素。