论文部分内容阅读
外界胁迫可诱导植物产生许多香气物质,一方面这些香气物质具有帮助植物抵御外界胁迫的作用,另一方面也可作为农业植物的重要品质成分。香气物质是茶(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.)叶的核心品质成分。在茶叶生长与加工过程中,多个胁迫参与茶叶香气形成。目前关于茶叶香气的生物合成和调控机制的信息大多借鉴于模式植物或其他作物,由于植物香气合成调控网络的复杂性与多样性,茶叶香气的形成信息有必要获得研究对象本身的证据。此外,茶叶本身含有一些特征性的香气成分,这些香气成分在茶叶的风味中发挥了重要贡献,但由于缺乏对这些特征性香气成分合成和调控关键因子的了解,极大制约了茶叶香气品质改良的创新。在茶香中,花香是主要的特征性香气,其合成主要来自于三大路径,分别是苯丙烷类、脂肪酸类及萜类合成路径。本论文研究旨在解决如下两个科学问题:(1)茶叶特征性花香成分是如何生物合成?(2)这些花香成分是如何响应外界胁迫的?本研究鉴定了茶叶中来自于三大合成路径的具有代表性的花香成分:吲哚(苯丙烷类)、茉莉内酯(脂肪酸类)以及(E)-橙花叔醇(萜类)。通过对吲哚、茉莉内酯、(E)-橙花叔醇生物合成的解析,以及关键非生物胁迫因子的挖掘,确定了这些花香成分的关键合成基因及非生物调控因子;另外,在探索胁迫因子时,发现这些物质都受低温和机械损伤的双因子胁迫调控。主要的研究结果如下: (1)在茶叶莽草酸衍生路径特征性花香成分吲哚的生物合成与胁迫响应机制研究中,通过稳定同位素示踪实验发现茶叶中的吲哚是从邻氨基苯甲酸路径经吲哚-3-甘油磷酸(IGP)合成而来的。茶叶的一个色氨酸合酶α亚基(TSA)和三个色氨酸合酶β亚基(TSBs)被分离、克隆和功能验证。研究发现大肠杆菌表达的重组蛋白CsTSA和CsTSB2只有结合才能催化吲哚-3-甘油磷酸(IGP)生成吲哚。此外,CsTSB2基因在乌龙茶做青过程中大量表达。模拟做青过程的连续机械损伤能显著增加CsTSB2基因的表达水平和吲哚的含量。这些结果表明:乌龙茶中吲哚的富集是因连续机械损伤胁迫而激活了CsTSB2基因的表达。同样受到机械损伤胁迫的红茶却几乎不含吲哚。同位素标记代谢物示踪实验表明红茶揉捻过程引起的细胞破碎不能导致吲哚的转化,而是终止了吲哚的合成。此外,低温(15℃)和机械损伤双胁迫对吲哚的合成具有协同作用,能通过激活CsTSB2基因的表达,从而促使吲哚的合成。 (2)在茶叶脂肪酸衍生路径特征性花香成分茉莉内酯的生物合成与胁迫响应机制研究中,通过稳定同位素示踪实验发现茶叶中的茉莉内酯生物合成路径并不是来自于不饱和脂肪酸(亚油酸和α-亚麻酸)经环氧脂肪酸形成的路径,而是来自于亚油酸和α-亚麻酸在脂氧合酶(LOX)催化作用形成过氧化氢脂肪酸的路径。通过原核表达和功能验证发现茶叶中的脂氧合酶CsLOX1是茉莉内酯合成上游路径的关键酶。乌龙茶做青过程的连续机械损伤通过激活CsLOX1基因的表达,从而催化不饱和脂肪酸生成大量的茉莉内酯。此外,低温(15℃)和机械损伤双胁迫对茉莉内酯的合成具有协同作用,能通过激活CsLOX1基因的表达,从而促使茉莉内酯的合成。 (3)在茶叶萜类合成路径特征性花香成分(E)-橙花叔醇的生物合成与胁迫响应机制研究中,通过原核表达功能验证和亚细胞定位分析筛选出了茶叶中定位于细胞质中的橙花叔醇合酶(CsNES),该酶能催化法尼基焦磷酸生成(E)-橙花叔醇。乌龙茶做青过程的连续机械损伤通过激活CsNES基因的表达,从而催化法尼基焦磷酸生成大量的E)-橙花叔醇。此外,低温(15℃)和机械损伤双胁迫对(E)-橙花叔醇的合成具有协同作用,能通过激活CsNES基因的表达,从而促使(E)-橙花叔醇的合成。 (4)在双胁迫对茶叶特征性花香成分生物合成的协同调控机制研究中,发现与单一胁迫相比,低温(15℃)和机械损伤双胁迫共同作用可显著提高茶叶特征性花香成分的上游信号物质茉莉酸的含量及其合成基因表达水平。外源性茉莉酸处理可显著提高吲哚、茉莉内酯、E)-橙花叔醇含量及其合成关键基因CsTSB2、CsLOX1、CsNES的表达水平。此外,低温和机械损伤共同处理可显著提高茉莉酸相关转录因子CsMYC2的表达水平。茶叶中一些特征性花香成分合成关键基因存在的启动子上含有多个G-Box,例如,吲哚合成关键基因CsTSB2的启动子上含有多个G-Box和G-Box like。采用瞬时转录激活技术进一步明确了低温和机械损伤共同处理下CsTSB2基因被激活是与茉莉酸相关转录因子CsMYC2相关。 本研究在理论方面率先功能鉴定了茶叶多个特征性花香成分合成基因,并提出双因子协同效应模型;在应用方面建立了安全有效的关键提香技术。研究结果不仅可以加深人们对茶叶香气生物合成的调控机制的了解,也为增进对植物香气及其主要上游信号物质茉莉酸响应双因子胁迫的认识提供了重要线索,此外,为将来利用植物对逆境胁迫的代谢应答机制应用于提高农产品的品质成分奠定理论基础。