背景与目的:阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是导致临床侵袭性真菌感染最常见的致病真菌之一。由于肿瘤、艾滋病等患者的增加,抗真菌药物的滥用,免疫抑制剂的大量应用,其发病率呈逐年上升的趋势。由T.asahii引起的播散性感染,急性期可迅速累及多个器官,引起菌血症、休克等,病死率可高达80%。以氟康唑为代表的三唑类抗真菌药由于安全性高、疗效好,已成为临床最常用的抗真菌药物。由于T.asahii对三唑类以外的大部分抗真菌药物均不敏感,因此氟康唑成为治疗T.asahii感染的首选药物之一。但在长期治疗和重复给药过程中发现其耐药程度越来越严重,相关研究、报道也不断增加。我们曾收治了国内首例播散性毛孢子菌病患者,在其皮肤、肝脏等病变组织中均分离到了氟康唑敏感的T.asahii菌株,此后该患者长期、间断、反复接受氟康唑等抗真菌药物的治疗。15年后我们在其面部新发皮损中再次分离到对氟康唑耐药的T.asahii菌株。这使得我们对T.asahii感染的治疗变得更加困难,但目前有关T.asahii的唑类耐药机制尚不清楚,因此研究该菌氟康唑耐药机制,寻找和开发新型抗真菌剂,降低T.asahii感染的病死率,具有十分重要的意义。方法:第一部分阿萨希毛孢子菌耐药菌株的分离鉴定1.体内临床耐药菌株分离鉴定:切取患者面部新发皮损,分别行病理检查和真菌培养。对培养所获菌株行显微镜检和IGS区PCR扩增测序鉴定。并参照药敏M27-A3方案检测其对氟康唑的MIC值。2.体外诱导耐药菌株分离鉴定:将首次分离的氟康唑敏感菌株A01S在体外通过不断增加氟康唑药物浓度的方法进行诱导培养,直至药物浓度≥128μg/ml,且菌株MIC值≥64μg/ml后再进行无药培养30代。第二部分阿萨希毛孢子菌耐药相关基因筛选分析1.构建DNA文库和基因组测序:提取同一患者先后分离的氟康唑敏感株和耐药株的DNA,使用KAPA DNA样品制备试剂盒构建配对末端文库,遵循标准样品制备方案并使用Illumina Hi Seq 3000进行基因组高通量测序。2.构建RNA文库和转录组测序:提取同一患者先后分离的氟康唑敏感株和耐药株的RNA,使用KAPA链RNA-Seq试剂盒构建RNA-Seq文库,遵循标准样品制备方案并使用Illumina HiSeq 3000进行转录组高通量测序。3.生物信息学分析:使用TopHat、FPKM、R package edgeR、ABySS、KOBAS、MEME、TOMTOM、PyMOL、TMpred、InterProScan、Clustal Omega(v1.1.0)等软件、公式去作图、评估、过滤、组装、比对、预测相关基因功能和结构等。第三部分ERG11基因耐药功能验证1.体外诱导耐药菌株转录组ERG11基因分析验证:提取体外诱导氟康唑耐药菌株的RNA,使用KAPA链RNA-Seq试剂盒构建RNA-Seq文库,遵循标准样品制备方案并使用Illumina HiSeq 3000进行转录组高通量测序。用相关生物信息学软件分析、比较ERG11基因表达变化。2.ERG11基因酿酒酵母转染药敏检测验证:提取体内敏感株和耐药株的RNA,反转录成cDNA,引物扩增ERG11基因全长。通过克隆和抽提等方法构建ERG11基因重组质粒,采用高效酵母转化试剂盒将重组质粒及空质粒转染至酿酒酵母。筛选含重组质粒的酿酒酵母基因工程菌的单克隆菌落,按M27-A3方案进行药敏实验。第四部分新型抗菌剂-纳米银对阿萨希毛孢子菌的作用1.检测纳米银对阿萨希毛孢子菌的药物敏感性:参照CLSI指南中的M27-A3方案测定17株临床及环境来源阿萨希毛孢子菌对纳米银以及7种常用抗真菌药物(5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、特比萘酚,伏立康唑)的MIC值。2.观察纳米银对阿萨希毛孢子菌形态的影响:在纳米银终浓度为0～32μg/ml的7种浓度PDA培养基上培养7天后观察测量菌落大小。然后选取4μg/ml纳米银处理后的临床标准菌株在扫描电镜和透射电镜下观察其大体形态及超微结构变化。结果:第一部分阿萨希毛孢子菌耐药菌株的分离鉴定1.体内临床耐药菌株分离鉴定:组织病理结果符合真菌感染性肉芽肿表现,PAS染色可见真菌样结构。组织培养到灰白色、脑回状真菌菌落,显微镜下可见关节孢子、菌丝等T.asahii形态结构。IGS区比对结果与T.asahii一致。氟康唑MIC值检测结果符合耐药菌株标准,将其编号为A15R。2.体外诱导耐药菌株分离鉴定:氟康唑诱导药物浓度达到64μg/ml时,诱导菌株的MIC值首次达到64μg/ml,当药物浓度≥128μg/ml时,其MIC值≥64μg/ml。经无药传代培养30代后,其MIC值稳定在64μg/ml,确定获得稳定的诱导耐药菌株,编号为A01R。第二部分阿萨希毛孢子菌耐药相关基因筛选分析1.DNA文库构建和基因组测序:成功构建DNA文库,基因组测序质量较好(Q30以上)。敏感株测了2G总数据量,高质量数据量1.7G,耐药株总数据量是1.5G,高质量数据量1.3G,可用率分别为84%和88%,覆盖度分别是70X和56X,数据量足以满足基因组拼接和突变检测分析。2.RNA文库构建和转录组测序:成功构建RNA文库,转录组测序进行了三个生物学重复,数据饱和度和质量均较好。发现总共24.7Gb高质量数据量,足以满足差异表达基因分析。3.生物信息学分析:基因组发现耐药菌株及敏感菌株的ERG11基因均有34个氨基酸的缺失。耐药菌株麦角甾醇生物合成途径部分相关基因突变,其中ERG11基因内含子4丢失,第1个内含子增加了346nt,发现36个氨基酸取代的新突变位点,均经一代测序验证。结构预测表明这些突变会引起蛋白相关结构的改变。ERG3发现了3个点突变(V458L,D457V和D334S)。ERG5发现1个突变位点(E349D)。转录组发现耐药菌株药物转运相关基因表达上调,包括6个ABC、1个MFS和1个MATE家族基因。包括ERG11在内的ERG相关的16个基因表达上调。ERG基因上游启动子区发现13个基因(ERG1-3,5-7,9-11,19,25,26和HMG)含有与转录调控有关的upc2p相似序列。发现了几种与氧化应激有关的抗氧化基因Cu/Zn SOD、GPx、TPx和应激蛋白DDR48表达增加。第三部分ERG11基因耐药功能验证1.体外诱导耐药菌株转录组ERG11基因分析验证:成功获取诱导耐药株转录组数据,分析发现耐药菌株ERG11基因表达上调,是敏感菌株表达量的3.7倍。2.ERG11基因酿酒酵母转染药敏检测验证:成功扩增敏感及耐药菌株ERG11基因全长,并构建为ERG11基因重组质粒,获得含重组质粒的酿酒酵母转化子,MIC值检测发现含敏感株ERG11基因的转化子的酿酒酵母氟康唑MIC值为≤8μg/ml,而含耐药株ERG11基因的转化子的氟康唑MIC值≥64μg/ml,分别验证为氟康唑敏感菌和耐药菌。第四部分新型抗菌剂-纳米银对阿萨希毛孢子菌的作用1.药物敏感性检测结果:17株T.asahii菌株纳米银的MIC值均为0.5μg/ml,明显小于5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、特比萘酚,略高于伏立康唑。同时对临床氟康唑耐药菌株也有很好的抑制作用。2.形态学观察结果:肉眼观察纳米银明显抑制了T.asahii菌落的生长,≤2μg/ml时无抑制作用,≥8μg/ml时完全抑制其生长,对环境株、临床株以及氟康唑临床耐药株间无差异。扫描电镜下见菌丝变得稀疏、细小、皱缩、细胞膜破损等。透射电镜下见细胞壁及细胞膜破裂、脱失、内容物外泄,染色质凝聚、边集、核糖体解聚、细胞基质变淡,以及细胞器退化形成的多泡体及髓样体等超微结构改变。结论:1.体内长期应用氟康唑可以导致阿萨希毛孢子菌耐药,体外单药诱导也可以获得稳定的耐药菌株。2.阿萨希毛孢子菌耐药分子机制复杂,麦角甾醇合成途径中的基因,特别是ERG11基因的突变、表达上调是其中的重要机制之一,同时还与药物外排转运基因、抗氧化应激基因等有关。3.新型抗真菌剂纳米银可以有效抑制阿萨希毛孢子菌的生长,包括氟康唑耐药菌株,并且可以严重破坏菌体的形态和超微结构。