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[目 的]在系统性筛选、评价、获得老年猕猴模型的基础上,利用老年多器官功能退变模型重点研究BMMSC对老年猕猴肺退行性变的影响。通过观察及测量分析肺组织结构变化。利用体外实验分析BMMSC对Ⅱ型肺泡上皮细胞的影响。通过对肺组织mRNA转录组测序及生物信息学分析,阐明BMMSC对老年猕猴肺退行性变的作用机制,为临床BMMSC治疗老年肺退行性变提供理论依据和技术基础。[方法]1.老年猕猴肺退变模型的评价将22-26岁的雌性老年猕猴作为评价对象,6-8岁青年猕猴作为青年对照,通过比较毛色、皮肤面容差异,分析其衰老状态。通过PEC-CT、HE染色、Masson染色、免疫组化,观察肺泡大小、炎症情况、肺泡间隔厚度,色素沉着情况、肺纤维化程度、肺泡周围毛细血管密度,通过ELISA测定外周血促炎因子TNF-α,IL-1β含量,通过Western blot,ROS染色,检测分析肺内促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6及ROS的表达水平,评价分析老年猕猴的肺退变状态,为BMMSC的治疗研究提供实验模型。2.幼年猕猴骨髓间充质干细胞的制备及鉴定采集幼年猕猴骨髓5ml,采用贴壁法分离培养获得骨髓间充质干细胞,观察P4代细胞的形态,生长特性,用CCK8检测其增殖能力。利用流式细胞术分析其CD29、CD45、CD73、CD90及CD184表面抗原的阳性率,用体外专用诱导培养基诱导其定向分化为骨、软骨、脂肪细胞,分析其分化能力。3.实验动物的分组及BMMSC治疗将上述筛选模型分为治疗组和老年对照组,并设置青年对照。将获得的P4代BMMSC按照2×106个/ml的浓度用生理盐水进行稀释。以每只猕猴1× 107个/kg的细胞剂量经股静脉输入BMMSC,隔天一次,连续输注3次,同时老年对照组和青年对照组猕猴同一时间输入等体积的生理盐水。注射完成后观察30分钟,确认猕猴无异样后放入笼中。4.BMMSC治疗后老年猕猴肺的组织结构观察通过PET-CT在BMMSC治疗前,治疗后90天、180天时观察肺影像学的变化;在细胞治疗180天后,麻醉处死猕猴,采集肺组织,观察拍照后。切取右肺,用4%的多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋切片,通过HE染色、Masson染色、免疫组化,观察治疗后肺组织结构(肺大体解剖、肺泡大小、炎症情况、肺泡间隔厚度,色素沉着情况、肺纤维化程度及肺泡周围毛细血管变化情况)变化;评价BMMSC治疗后肺组织退变的改善情况。5.BMMSC对老年猕猴ROS、炎症相关因子含量及VEGF含量的分析分别在BMMSC治疗后0天、30天、60天、90天采取猕猴外周血,制备血清,通过ELISA分别检测各时间段猕猴外周血炎症因子IL-1β、IL-17A、TNF-α含量的变化;取左肺置于液氮中,冰冻切片,通过ROS染色,测定BMMSC治疗后肺组织ROS表达水平的变化;取出左肺,提取蛋白后,通过Western blot检测肺组织中促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β、抑炎因子IL-10的表达水平,分析炎症水平的变化;通过Western blot检测BMMSC治疗后肺组织中VEGF表达水平的变化;评价BMMSC治疗后相关因子表达水平的改善情况6.BMMSC治疗对老年猕猴外周血Treg细胞比率及肺组织FOXP3表达水平的影响的分析分别在BMMSC治疗后,0天、30天、60天、90天,采取外周血,分离淋巴细胞,通过流式细胞术检测外周血中Treg细胞比率的变化;利用FOXP3标记Treg细胞,通过免疫组化分析肺内FOXP3表达水平的变化7.BMMSC对Ⅱ型肺泡上皮细胞的影响分析将 A549 细胞分别置于含 200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L、1200μmol/L过氧化氢的完全培养基中,通过β-半乳糖苷酶染色及RT-PCR对P53基因表达量的测定确定诱导的过氧化氢最佳浓度后,通过RT-PCR定量TERT、TCAB1、P53、P21的表达,确定在此过氧化氢浓度下A549细胞衰老的有效性和稳定性,以此为基础建立Ⅱ型肺泡上的细胞(A549细胞)的衰老模型;在建立Ⅱ型肺泡上皮细胞衰老模型后,通过transwell体系与BMMSC共培养,分别利用RT-PCR以及流式细胞术,定量P53、P21、TCAB1表达情况,以及两组间细胞凋亡、ROS及细胞周期的变化;通过免疫组化的方法,以proSPC、ki67为标记,观察肺组织内Ⅱ型肺泡上皮细胞的数量及增殖情况,并计数。8.BMMSC治疗后转录组测序分析采用二代测序技术,对猕猴肺组织中mRNA测序,利用生物信息学方法对测序数据进行分析,比较不同年龄段猕猴mRNA转录的差异,筛选出与衰老相关基因。再通过3D PCA、聚类及轨迹分析,比较这些衰老相关基因在治疗前后的变化。再次利用生物信息学方法,通过GO富集分析,观察其主要富集的通路。9.统计学分析所有数据统计分析均采用SPSS 21.0统计学软件进行,计量结果数据均采用均数±标准差((?))表示,三组及以上结果数据采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学分析。[结 果]1.老年猕候肺退变模型评价(1)老年猕猴表现出比青年猕猴具有更多的衰老特征(老年猕猴毛色变白、无光泽,面容衰老,皮肤褶皱)。(2)通过PET-CT观察,发现青年猕猴肺部纹理清晰,小叶间隔无异常。而老年猕猴双肺纹理呈网格状、磨玻璃影及蜂窝状改变,肺气肿征象明显,小叶间隔不规则增厚,小叶内的细小血管由于壁的增厚而变得明显,CT值减低(P<0.05),而SUVmax值升高(P<0.05)。(2)取材后通过肉眼观察,老年猕猴肺体积明显大于青年猕猴,且肺中有明显的色素沉积。(3)通过HE、Masson、免疫组化发现,青年猕猴肺内结构清晰,肺泡壁薄而光滑,肺泡腔中无渗出物,而老年猕猴虽肺泡壁厚度无明显改变,但肺泡腔可见不规则扩大,并有肺大疱形成,少量血管周围炎性细胞灶性浸润伴色素沉着。总体来说,老年猕猴与青年猕猴相比炎症更严重,具有更高纤维化程度(P<0.05)、更低的CD31表达水平(P<0.05),肺内结构更紊乱。(4)通过ROS染色、ELISA及western blot结果来看,老年猕猴肺组织具有更高的ROS表达水平(P<0.05),血清中IL-1β、TNF-α含量及肺内IL-1β、TNF-α表达水平与对照组相比明显升高(P<0.05),具有更高的炎症及氧化应激水平。2.BMMSC的分离培养及鉴定结果采用贴壁培养法,分离培养猕猴BMMSC,发现3-4 d开始出现细胞贴壁生长,通过换液,9-10天时细胞融合达到80%左右,传代到P4代时细胞进一步纯化,贴壁的细胞形态均一,呈漩涡状密集生长。P4代BMMSC成脂诱导分化后饱和油红O染色成阳性,成骨诱导分化后茜素红染色阳性,成软骨诱导后阿尔新蓝染色阳性。通过流式细胞术检测,发现CD29、CD45、CD73、CD90、CD184的阳性率分别为 96.35±0.62、0.16±0.12、95.22±0.37、96.25±1.71、93.53±2.76,符合间充质干细胞的标准。增殖检测,生长曲线呈“s”型,基本符合细胞生成趋势。3.BMMSC治疗后老年猕猴肺组织结构的变化(1)BMMSC治疗后,所有猕猴均无异常,治疗后90天、180天PET-CT显示与治疗前相比肺部CT值明显增加(P<0.05),SUVmax明显减低(P<0.05)。(2)治疗后肺部取材大体观察,老年对照组与治疗组猕猴肺组织外观并无明显变化。(3)通过HE染色及Masson染色分析,与老年对照组相比,治疗组肺泡平均面积、MLI并无明显的变化(P>0.05),治疗组纤维化程度明显减低(P<0.05)。(4)免疫组化结果显示,与老年对照组相比,治疗组肺泡周围CD31表达水平明显增多(P<0.05)。4.BMMSC对老年猕猴外周血及肺组织中炎症相关因子及VEGF含量的影响(1)BMMSC治疗后,治疗组与老年对照组相比肺组织中ROS表达水平明显降低(P<0.05)。(2)BMMSC治疗后,治疗组与老年对照组相比肺组织内促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平明显降低(P<0.05),抑炎因子IL-10表达水平明显升高(P<0.05)。治疗后血清中促炎因子IL-1β、TNF-α含量在0-60天下降(P<0.05),在90天时恢复到治疗前水平,IL-17A水平并无明显的变化(P>0.05)。(3)BMMSC治疗后,治疗组与老年对照相比肺组织内与血管生成有关的因子VEGF表达水平明显升高(P<0.05)。5.BMMSC治疗对老年猕猴外周血Treg比率及肺组织FOXP3表达水平的影响(1)在BMMSC治疗后,外周血中Treg细胞比率与老年对照组相比在0-60天持续下降(P<0.05),且在60-90天时保持稳定。(2)BMMSC治疗后,治疗组肺组织内FOXP3表达水平与老年对照组相比明显降低(P<0.05)。6.BMMSC对Ⅱ型肺泡上皮细胞衰老模型的作用(1)在含不同浓度的过氧化氢培养基诱导A549细胞后,通过β-半乳糖苷染色及RT-PCR检测衰老相关基因的表达量发现在600μmol/L时,其衰老细胞率及衰老相关基因P53、P21、TCAB1、TERT表达量最高,且在72h后,仍具有稳定性。(2)衰老Ⅱ型肺泡上皮细胞与幼年猕猴BMMSC间接共培养后,前者P53、P21表达量明显下降(P<0.05),TCAB1表达量明显上升(P<0.05),且其细胞凋亡率、ROS水平明显减少(P<0.05),细胞增殖加快向G2期增加。(3)BMMSC治疗后,治疗组与老年对照组相比肺组织内Ⅱ型肺泡上皮数量明显增多(P<0.05),且其中增殖细胞数量增多。7.BMMSC对肺退变影响的机制BMMSC治疗后,通过对肺组织中mRNA转录组测序和生信分析,发现肺组织转录组表达特征相比模型组有趋向于年轻猕猴肺表达特征的倾向,通过GO富集,发现治疗后随衰老上调治疗后下调基因主要富集在纤维蛋白凝块形成的共同途径,急性炎症反应,适应性免疫反应及体液免疫反应等上。随衰老下调,治疗后上调基因主要富集在胚胎发育结束或卵孵化,脂肪细胞的分化,血管的形态发生、骨架系统的发展、PID P53下游通路、骨化、肌肉细胞的分化等通路。[结 论]1.本研究成功获得老年肺退行性变猕猴模型表现为:肺泡腔变大,肺内结构紊乱,色素沉着,纤维化程度增加,毛细血管密度降低,氧化应激及炎症水平升高。2.通过贴壁培养法,可获得CD29、CD73、CD90、CD184阳性率90%以上,CD45阳性率10%以下,具有成脂、成骨、成软骨能力,符合间充质干细胞标准的 BMMSC。3.BMMSC治疗可降低老年猕猴肺纤维化的程度,肺内及外周血中炎症水平,提高肺组织中VEGF的表达,增加肺泡周围毛细血管的密度,同时降低外周血及肺组织中的Treg细胞。4.BMMSC与Ⅱ型肺泡上皮细胞共培养,减少其衰老相关基因的表达,减少其凋亡和氧化应激水平,促进增殖。BMMSC治疗可增加肺组织内Ⅱ型肺泡上皮的数量。5.BMMSC可逆转肺组织转录组老年相关转录变化,在脂肪细胞分化、血管形态发生、体液免疫、适应性免疫等通路上改善肺衰老相关退变。