伴随人类生活质量不断地提高,恶性疾病,如癌症的发生同样也给人类造成了相当大的困扰。对疾病发生、发展过程中产生的特征生物标志物进行实时检测与监控,这便于我们探究其内在机理,并大大有助于疾病的预防、诊断与治疗。随着科技的不断进步,各类检测手段均得到了长足的发展。其中,荧光成像技术因其具有灵敏度高、响应速度快且能对分析物实现实时、原位成像等优点,在环境监测、食品分析以及疾病诊断等领域内扮演着举足轻重的角色。然而传统的小分子荧光探针因激发波长短,致使其具有光稳定性差、生物背景荧光影响大、样品组织穿透深度小等一系列缺点;这很大程度上限制了传统小分子荧光探针在生物成像方面的应用。为了将荧光成像技术更好地应用于生化分析、传感等领域,设计和开发长波长激发的小分子荧光探针迫在眉睫。基于双光子、近红外荧光成像技术的优良特性,本论文构建了一系列结构新颖、性质优良的小分子荧光探针;并将它们成功的应用于各类生理过程中活性分子、蛋白酶以及微环境的实时监测与成像研究。具体内容如下:(1)在第二章中,针对传统的小分子荧光探针激发波长短的问题,我们设计合成了“turn-on”型的双光子荧光探针用于细胞内弗林蛋白酶(furin)的检测与缺氧成像。Furin是前体蛋白转化酶家族(PCs)中最具特色的酶之一,在激活生物活性物质中起着至关重要的作用。同样地,癌症的发生及其严重程度与furin的表达呈正相关。我们利用一个能自消除的连接体(4-氨甲基哌啶)实现了双光子荧光基团-萘酰亚胺与furin特异性的底物序列(RVRR)之间的整合;从而得到了一个对furin特异性响应的双光子荧光探针Nap-F。基于探针与furin作用前后分子中电荷分布的变化,Nap-F表现出turn-on的荧光信号变化。此外,由于furin蛋白酶的表达水平与生理环境的氧含量密切相关,探针Nap-F成功地实现了肿瘤细胞缺氧微环境的成像与检测。(2)由于现存的大多数furin荧光探针的发射波长位于可见光波段,阻碍了活体层面furin的检测与分析以及furin在疾病发生过程中作用机理的探索。据此,在第三章中,我们设计合成了一个近红外发射的荧光探针HD-F用于furin活性的检测。该探针对furin具有优异的特异性与灵敏度;不仅能实现对各类细胞裂解液中furin的检测;更为重要的是,HD-F能成功地应用于各类细胞中furin表达差异的可视化,并且能明显地区分正常细胞与癌症细胞。此外,HD-F也成功应用于肿瘤组织以及活体小鼠肿瘤中furin的成像,揭示了furin在肿瘤中的过度表达。(3)次氯酸(HClO)作为一类经典的活性氧类(ROS)物质,在各种生命活动中均扮演着重要的角色。现存的HClO荧光探针在检测过程时常受到其他ROS的影响,尤其是ONOO~-。为了解决这一问题,在第四章中,我们通过将二硫代螺内酯结构整合到硅罗丹明B(Si-Rh B)分子中,设计并合成了一种新型的具有溶酶体靶向的近红外荧光探针Lyso-SiR-2S。相比于传统的羧酸硫内酯类探针,该探针对HClO具有更高的反应活性以及选择性,成功的避免了HClO检测过程中ONOO~-等活性氧物质的干扰。此外,Lyso-SiR-2S成功地实现了细胞中外源性以及内源性HClO的检测,并对细胞溶酶体表现出良好的靶向效果。这一探针的设计与开发为HClO的临床检测提供了有效的工具。