论文部分内容阅读
第一部分肝癌组织特异性蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的影响 目的：构建肝癌组织特异性启动子驱动的蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体（dominate negative form of protein phosphatase 2A catalytic subunit α，DN-PP2Acα）表达载体，研究其对肝癌细胞生长的影响。 方法：将甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）基因的增强子和磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，pgk）基因的启动子组合形成的肝癌组织特异性 AFpg启动子。采用定点突变将野生型PP2Acα突变为DN-PP2Acα。将AFpg启动子和DN-PP2Acα编码序列构建成AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体。荧光素酶报告基因实验检测AFpg启动子的转录活性。Western印迹检测PP2Ac表达水平。MTT检测细胞生长。 结果：AFpg启动子在表达AFP的细胞中具有高转录活性。AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体可特异性地使DN-PP2Acα表达于AFP阳性肝癌细胞HepG2和Hep3B，并抑制其生长。转染72h后使HepG2细胞活力下降（42.65±3.99）%，P=0.0002；使Hep3B细胞活力下降（39.87±3.91）%，P=0.0002。而对AFP阴性细胞的生长无明显影响。 结论：AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体特异性地抑制AFP阳性肝癌细胞的生长，可用于肝癌组织特异性基因治疗。 第二部分肝癌组织特异性蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体表达载体抑制肝癌生长的体内研究 目的：构建腺病毒为载体的肝癌组织特异性启动子驱动的蛋白磷酸酶2A催化性C亚基α亚型显性负性突变体（dominate negative form of protein phosphatase 2A catalytic subunit α，DN-PP2Acα）表达载体，研究其对肝癌生长的影响。 方法：第一部分研究中已构建甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）基因增强子和磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，pgk）基因启动子组合形成的肝癌组织特异性AFpg启动子，并将AFpg启动子和DN-PP2Acα编码序列构建成AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体。将该载体重组到腺病毒载体中。Western印迹检测PP2Ac表达水平。MTT、平板克隆形成实验检测细胞生长。流式细胞术检测细胞周期。荷瘤裸鼠进行体内研究。 结果：AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体可特异性地使DN-PP2Acα表达于AFP阳性肝癌细胞，并抑制肝癌细胞及肝癌移植瘤的生长，而对AFP阴性细胞的生长无明显影响。 结论：AFpg启动子调控的DN-PP2Acα表达载体特异性地抑制AFP阳性肝癌细胞的生长，可用于肝癌组织特异性基因治疗。