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草甘膦是一种有机磷类除草剂,通过基因工程手段在常规大豆品种中导入抗除草剂基因后获得的大豆加工而成的豆粕就是抗草甘膦转基因大豆豆粕。本研究以抗草甘膦转基因豆粕为试验材料,进行检测方法研究。目的是为制定转基因豆粕的检测规程提供依据,为我国转基因产品管理制度的建立与实施提供可行的检测方法。本文通过对四种基因的检测,初步建立了转基因豆粕的检测方法,获得的结果如下:
1.对转基因豆粕中的Lectin基因,CaMV35S基因,NOS基因以及CP4-EPSPS基因进行:PCR反应,经对退火温度和dNTP浓度条件优化,结果最佳条件下扩增出目的基因片断,分别将它们克隆后进行序列测定,并对CaMV35S基因和NOS基因进行了酶切鉴定。结果证明目的基因扩增正确。
2.根据已发表序列,将内源基因分别与CaMV35S基因,NOS基因和CP4-EPSPS基因进行多重PCR扩增,并对它们的退火温度和引物比例进行条件优化,确定Lectin与CaMV335S,NOS和CP4-EPSPS的多重PCR反应退火温度和引物不对称比例分别分别为61℃,58℃,58℃和5:1,1:1,1:1。结果证明多重:PCR能同时扩增出多条目的条带,快速经济,适合大面积推广。
3.在此基础上,针对CaMV35S基因和。NOS基因设计引物和探针,对扩增产物作杂交检测。试验结果表明:包被液EDC的浓度在5.15mmol/L之间DNA结合量变化不大;上下游引物比例8:1时适合ELISA检测同时适合电泳检测;液相产物和固相产物的杂交时间分别为40min和60min;变性时间10min。加入标准对照后则可以使转基因产品不仅能定性检测而且可以定量检测。