目的 探讨黄芪川芎有效部位配伍并选择各有效部位的代表成分在脑缺血损伤大鼠血浆中的药代动力学及药效学变化,并建立PK-PD模型,从而科学的评价中药配伍在脑缺血模型动物体内的作用及其机制,为临床治疗心脑血管疾病、方剂学配伍规律研究和中药现代化提供参考。方法(1)黄芪川芎有效部位配伍的药动学研究:①建立高效液相色谱法(HPLC)测定大鼠血浆中各有效部位代表成分(毛蕊异黄酮,川芎嗪,阿魏酸)的含量。采用梯度洗脱法,甲醇占流动相体积百分比随着时间的增加而增加;0-5min,25%-25%;5-6min,25%-35%;6-10min,35%-60%;10-14min,60%-60%;柱温:30℃;流速 1 mL.min-1;检测波长 0～9 min,280 nm;9～12 min,320 nm;12～14 min,254 nm。②采用正交设计法(L934)将黄芪川芎有效部位(黄芪总皂苷,黄芪总黄酮,川芎生物碱,川芎有机酸)配成9个用量配比不同的组方,将SD大鼠随机分成9个不同的组方组,并建立脑缺血再灌注模型,于再灌注同时灌胃给予 9 个组方药,给药后 0.083、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0 h眼眶取血0.5 mL置于1.5 mL含肝素钠的EP管中,并用HPLC法测定各有效部位代表性成分(毛蕊异黄酮,川芎嗪,阿魏酸)在血浆中的含量,采用DAS 3.2.6药动学软件进行药动学参数的计算。(2)黄芪川芎有效部位配伍的药效学研究:将黄芪川芎有效部位(黄芪总皂苷,黄芪总黄酮,川芎生物碱,川芎有机酸)配成9个用量配比不同的组方,将SD大鼠随机分成9个不同的组方组,并建立脑缺血再灌注模型,于再灌注同时灌胃给 予’9 个组方药,于给药后 0.083、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0 h眼眶取血0.5 mL置于1.5 mL含肝素钠的EP管中,用试剂盒检测血浆中乳酸脱氢酶(LDH)活性。结果(1)毛蕊异黄酮、川芎嗪、阿魏酸分别在0.469 μg·mL-1～30 μg·mL-1、2.5μg·mL-1～100 μg·mL-1、0.3125 μg·mL-1～20μg·mL-1线性范围良好,线性方程和相关系数分别为:Y=0.1273x-0.0479,R2=0.9984,Y=0.0023x+0.0009,R2=0.9991,Y=0.1066x+0.0054,R2=0.9994。毛蕊异黄酮平均相对回收率均大于90%(RSD<6%)。川芎嗪平均相对回收率分别为:98.30%(RSD=3.02%):97.16%(RSD=7.65%);94.05%(RSD=8.74%)。阿魏酸平均相对回收率分别为:98.08%(RSD=7.44%);92.81%(RSD=7.25%);93.0%(RSD=4.27%)。各成分的日内和日间变异系数RSD均小于10%,符合生物样品的分析要求。(2)再灌注口服给以有效部位配伍的9个组方,按上述时间点采血并计算出各时间点的平均血药浓度,经药动学软件处理后得到各指示性成分主要药动学参数。采用非房室模型对毛蕊异黄酮、川芎嗪、阿魏酸进行药动学分析。再灌注同时给予不同配伍组后毛蕊异黄酮的药动学曲线变化都为双峰现象。第1、2、4组的Cmax值显著高于其他组。第1、4、5组达峰值(Tmax)显著小于其他各组。第2、6组方的AUC值明显高于其他组。9个组方在给药后在大鼠体内的平均驻留时间(MRT)差异不大,维持在3h左右。灌胃给予不同组方的药物后,通过计算得到川芎嗪的药时曲线,发现第四组为单峰,其他各组均为双峰。第2、4、6和7组Cmax组明显高于其他组。第3、4、9组的达峰时间(Tmax)明显小于其他组。第6组方AUC(0-t)显著高于其他组方,其次为第2、4、7组方组。9个不同的组方在MRT方面基本维持在2～3h左右,其中第1、6、7、8组都接近于3 h,大于其他各组。灌胃给予9个不同组方后阿魏酸的浓度随时间的变化大都呈下降趋势,只有第1、7、9组出现了单峰现象。4号组方的Cmax显著大于其他各组,其值为24.611μg·mL-1,其次为2号组方的15.128μg·mL-1,再次为3、6、8组的9.405、9.364、9.994 μg·mL-1。给药后的9个不同组方大部分都在0.083 h达到了峰值,只有第1、7、9组分别在0.5h、0.25h和0.167h达到峰值。第2、3、4组的AUC值显著高于其他组。灌胃给予9个不同组方后阿魏酸在大鼠体内的平均驻留时间以第7组为最高。(3)大鼠脑缺血再灌注损伤后,与正常组相比血浆中LDH活性显著提高(P<0.01);口服给予有效部位配伍的9个组方,各时间点较模型组血.浆中LDH活性均有不同程度的降低,且9个组方于再灌注2h以前能发挥更好的药效作用,其中组方3、4、5、7、9较其他各组能更显著的降低血浆中LDH活性(P<0.01)。通过软件进行模型拟合比较最终建立了以效应室联结的(?)PK-PD模型。结果发现各组方Emax明显滞后于血药浓度的峰值Tmax,给药后每一时间点上的血药浓度值和药物效应值不是严格一对应关系,出现了效应明显滞后于血药浓度的现象,血药浓度的改变和药物效应的变化不同步。结论(1)本实验中液相色谱条件方法简便、可靠、灵敏、稳定;线性范围良好,回收率高,精密度良好,适用于毛蕊异黄酮、川芎嗪、阿魏酸在大鼠体内的药动学研究。(2)对毛蕊异黄酮的药动学参数分析发现,1、2、4组方在给药后毛蕊异黄酮的吸收效果显著好于其他组;第1、4、5组这三个组方在给药后,毛蕊异黄酮的吸收速度较快;第2、6组生物利用度优于其他各组;给予9个组方后,毛蕊异黄酮的平均驻留时间都较长,能够维持耐久的药效特性。川芎嗪的药动学参数显示,第3、4、9组相对于其他组方对川芎嗪的吸收效速度较快;第6组方川芎嗪的吸收程度最大,生物利用度显著高于其他组方,其次为第2、4、7组方:1、6、7、8这四个组方在给药后在大鼠体内的平均驻留时间高于其他组,药物发挥的作用更持久。对阿魏酸药动学参数分析情况来得出:4号组方在给药后对促进大鼠对阿魏酸的吸收效果更为显著;9个组方在给药后很快就被吸收,且随着时间的延长大都出现了下降趋势;第2、3、4组的AUC值显著高于其他组,说明阿魏酸的吸收程度较大,生物利用度显著高于其他组方。7组方在给药后阿魏酸在大鼠体内的驻留时间较长,药效更持久。(3)大鼠脑缺血再灌注损伤后,与正常组相比血浆中LDH活性显著提高(P<0.01);口服给予有效部位配伍的9个组方,各时间点较模型组血浆中LDH活性均有不同程度的降低。组方1能在再灌注4h以前显著降低血浆中LDH活性,发挥更好的药效作用。组方2只在再灌注2h能够显著降低血浆中LDH活性;说明组方2在再灌注2h时更能发挥治疗作用。组方6、8在再灌注1h以前均能显著降低血浆中LDH活性,说明组方6、8在再灌注1h以前更能发挥药效作用;再灌注1h后血浆中LDH活性出现较大波动,这可能与口服给药药物浓度出现双峰现象有关。组方3、4、5、7、9在每个时间点叫其他各组都能显著降低血浆中LDH活性,对脑缺血再灌注损伤治疗作用方面较其他组疗效更显著。