免仪器定量生化分析技术因具有操作简单、成本低廉、可应用于资源严重匮乏环境下的现场分析和即时检验（Point-of-Care Testing）等诸多突出优点,近年来受到了各国科学家的广泛关注。本论文以二价铜离子(Cu²⁺)、碱性磷酸酶和腺苷为模型分析物,利用基于测距原理的免仪器定量信号量测机制,着重结合纸微流控分析装置（Microfluidic Paper-Based Analytical Device,μPAD）,开发了一系列低成本高性能的免仪器定量生化分析新方法。其主要内容如下:（1）在第二章中（第一章为整个硕士论文的绪论）,首次提出了一种基于μPAD和测距策略的Cu²⁺离子免仪器定量检测新方法。当样品中存在Cu²⁺时,分析物可高效抑制糖化酶活性,使得淀粉不被该酶水解。由于淀粉具有极小的水溶性,其滴加到经激光切割制备的条状μPAD中后,可显著提高相应部分的疏水性。这导致仅有少量的彩色检测试剂溶液（即红墨水）可以流过该区域进入到条状纸装置中的量测区,产生较短的流动长度。该流动长度与样本中Cu²⁺浓度大小呈反比。因此,通过简单量测纸装置中红墨水溶液的流动长度即可进行Cu²⁺的定量检测。研究结果表明,在优化的实验条件下,新方法定量检测Cu²⁺的线性范围为3.2×10^-95.0×10^-55 M,目视检测下限为3.2×10^-99 M。（2）在第三章中,以第二章的研究结果为基础,进一步利用焦磷酸对Cu²⁺离子的独特、超强的络合作用以及碱性磷酸酶对焦磷酸的生物催化水解机制,成功开发了一种基于条状μPAD的碱性磷酸酶活性免仪器测距定量检测新技术。当样品中没有碱性磷酸酶或其活性较低时,未被水解的焦磷酸可以络合Cu²⁺离子,使其不能抑制糖化酶的活性。低水溶性的淀粉大分子将被糖化酶水解,生成水溶性优异的葡萄糖小分子,导致条状μPAD中相应部分的纸体可保持其原始亲水性。从而大量的红墨水溶液可以流过该区域进入到纸装置中的量测区,产生较长的流动长度。该流动长度与样本中碱性磷酸酶的活性大小呈反比。实验结果表明,在优化的实验条件下,新方法定量检测碱性磷酸酶活性的线性范围为0.0375⁵U/mL,目视检测下限为0.0375 U/mL。同时,该法表现出良好的检测特异性,且实际人全血样品回收率实验结果令人满意。据我们所知,这是碱性磷酸酶活性免仪器定量检测方法的第一个成功范例。（3）在第四章中,同样基于糖化酶-淀粉生物催化反应介导μPAD发生可控的润湿性改变原理和测距策略,以糖化酶为酶标记探针,结合超顺磁性微珠分析平台,发展了一种低成本的核酸适配体生化分析新方法,以实现对腺苷模型分析物的免仪器定量检测。使用红墨水作为彩色检测试剂,其在纸装置中量测区的流动长度与样品中腺苷浓度呈正比。实验结果表明,在优化的实验条件下,新方法定量检测腺苷的线性范围为1.7⁶2.5μM。根据“S/N=3”规则估算该法的检测下限为1.6μM。此外,所发展的核酸适配体生化分析方法还表现出优异的检测特异性。