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背景：生物治疗是继手术、放疗和化疗三大传统肿瘤治疗方法后新兴的一种治疗手段。生物治疗的理想模式，是诱导肿瘤细胞自身生长的停滞或凋亡和提高肿瘤的免疫原性，诱导机体产生特异性抗肿瘤的T淋巴细胞。超抗原(SAg)是一族具有免疫刺激作用并可致病的蛋白，与传统意义上的普通抗原不同，无需经过抗原递呈细胞(APC)的加工处理，直接与APC膜上的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子的肽结合沟外侧的高度保守区结合，强烈诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性及细胞因子产生。葡萄球菌肠毒素A(SEA)是SAg家族的重要成员，是迄今为止人类和小鼠T细胞最强的有丝分裂原之一。动物实验和临床研究都证实SEA有显著的抗肿瘤效应。然而，单用SEA进行肿瘤免疫治疗效果并不理想。由于SEA抗原谱广，易产生全身毒性反应，极微量就可激活大量T细胞，从而引起一系列自身免疫性疾病，且SEA在杀伤主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ+肿瘤细胞的同时也严重影响正常MHCⅡ+细胞。所以，SEA的抗肿瘤作用受MHCⅡ类分子限制，治疗范围受到限制。我们设想将超抗原导入肿瘤细胞，可增强肿瘤细胞的免疫原性，有效地活化T细胞，产生抗肿瘤免疫。目的：本研究拟采取基因重组的方法，把超抗原SEA的基因转染至肿瘤细胞，观察转染了SEA基因的肿瘤细胞对T淋巴细胞增殖的影响；探讨其促使T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力，为进一步研究超抗原SEA在肿瘤治疗中的作用打下基础。
方法：1)从产SEA标准菌株ATCC13565中提取细菌基因组，用PCR法扩增SEA全长基因；2)将SEA基因克隆至克隆载体pGEM-T构建pGEM-T-SEA重组质粒并鉴定；3)将SEA基因亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒并鉴定；4)将pLXSN-SEA重组质粒转染至人肝癌细胞系Bel-7402细胞，用RT-PCR法和ELISA法鉴定；5)将转染及未转染肝癌细胞与脐血来源单个核细胞(CBMC)混合，用3H-TdR掺入法检测转染肝癌细胞刺激CBMC增殖的能力；6)用MTT法比较细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)杀伤转染及未转染肝癌细胞活性的差异；7)ELISA法检测SEA蛋白与转染SEA肝癌细胞对Th1/Th2型细胞因子的影响。
结果：1)从产SEA标准菌株ATCC13565中提取细菌基因组，用PCR法扩增出SEA基因全长片段；2)将SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒，经上海博亚公司测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；3)表达SEA的肝癌细胞系Bel-7402-SEA的获得。将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞Bel-7402，经G418筛选获得稳定表达的抗性单克隆。提取细胞总RNA，以SEA引物，RT-PCR扩增出约800bp的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在pg的水平。4)CIK细胞对转染SEA细胞的杀伤效率比对Bel-7402细胞的杀伤效率强，且随着效靶比的增加，杀伤率的差别逐渐加大。在效靶比为40:1时，杀伤率的差别最大。5)转染SEA细胞比Bel-7402细胞更能促使CBMC的扩增，且随着混合比由1:1000增高到1:10，液闪记数cpm值渐增高，在混合比为1:10时cpm值达高峰。6)经SEA刺激3天后，不同浓度的SEA(10-5～10ug/ml)均表现出了不同程度的促增殖作用，当浓度为100ng/ml时，细胞增殖最显著，说明T细胞增殖与SEA浓度有关，但并不成正相关性，浓度过高或过低均不利于细胞的生长。7)当SEA浓度＞500pg/ml时，SEA诱导T淋巴细胞分泌Th2样细胞因子IL-10为主；当SEA浓度＜100pg/ml时，SEA诱导T淋巴细胞分泌Th1样细胞因子IFN-γ为主；8)加入转染SEA肝癌细胞组诱导T淋巴细胞分泌Th1样细胞因子IFN-γ为主。
结论：1)我们成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体；2)将SEA基因转染至肝癌细胞株Bel-7402细胞，癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白；3)CIK细胞杀伤转染了SEA基因的肝癌细胞的能力增强，最佳效靶比为40：1；4)SEA浓度＞500pg/ml时，主要促进T淋巴细胞分泌Tc2/Th2样细胞因子；SEA浓度＜100pg/ml时，主要促进T淋巴细胞分泌Tc1/Th1样细胞因子；转染SEA肝癌细胞主要诱导T淋巴细胞分泌Tc1/Th1样细胞因子。