棘白霉素类药物是一类重要的半合成抗真菌抗生素,批准临床应用的有米卡芬净、阿尼芬净和卡泊芬净。米卡芬净和阿尼芬净的合成过程均包含一步由犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis NRRL12052)执行的脱酰化反应,该反应由棘白霉素脱酰酶(ECB脱酰酶)催化。当前,我国相关制药企业在该步反应中仍然采用犹他游动放线菌野生菌发酵转化的工艺,由于野生菌发酵生产的ECB脱酰酶表达量不高,催化反应的底物浓度仅能达到1-2g/L,无法满足大规模工业化生产。因此,通过构建基因工程菌生产ECB脱酰酶,提高该酶的表达量,具有重要的应用价值。本课题旨在构建可适应工业化需求的ECB脱酰酶高效表达基因工程菌。选择与犹他游动放线菌近亲且表达体系成熟的变铅青链霉菌为表达宿主,从犹他游动放线菌中获取ECB脱酰酶的基因序列,随后与链霉菌表达载体pNW-S1连接,通过原生质体转化的方法获得基因工程菌株。结果显示,在摇瓶发酵水平上,ECB脱酰酶在基因工程菌中表达量为野生菌株的10倍,酶活为125U/L；且ECB脱酰酶在基因工程菌中为分泌表达,发酵液离心后的发酵上清可用于生产,明显优于犹他游动放线菌的全细胞发酵转化。通过发酵放大实验,在300L发酵罐上,该基因工程菌的酶活可达到80U/L。以米卡芬净的原料FR901379的脱酰反应为例,FR901379在基因工程菌发酵上清中的投料浓度可达到15g/L,摩尔转化率为100%。此外,为了便于该酶的生产保存和应用,本课题还对该酶的粗纯化及固定化等工作进行了研究。本课题对棘白霉素脱酰酶基因工程菌的研发,势必有助于升级改良当前棘白霉素类药物的生产工艺。