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背景：缺血性脑卒中发病率高、死亡率高、致残率高，严重危害人类健康，在我国是仅次于癌症的第二大致死性疾病。近年来的研究指出，心脏外科、神经外科、血管外科患者围手术期脑卒中发病率高达5.5%~9.7%。许多的临床研究表明，缺血性脑卒中是围手术期脑卒中最主要的分型，而与手术麻醉相关的缺血性脑卒中则被公认为围术期严重的并发症之一。
大脑血流供应障碍引起缺血、缺氧。缺血区的神经元由于氧气和能量缺乏导致不可逆性坏死、凋亡，出现相应神经功能缺损。缺血脑组织可产生氧化应激、炎症反应及释放大量具有神经毒性的兴奋性氨基酸，这些继发性改变都会进一步损害神经功能，导致暂时性或永久性的神经功能受损。当前，脑缺血的治疗药物非常有限。缺血性脑卒中急性期最有效的治疗药物是具有溶栓作用的重组组织型纤溶酶原激活剂（r-tPA）。r-tPA已在临床使用多年，但由于时间窗过短（4.5个小时之内），仅有不到5%的患者能够及时应用r-tPA治疗。此外，溶栓有增加继发性出血的风险，受凝血功能的影响，很多符合溶栓时间窗的脑梗死患者并不能使用r-tPA治疗，导致许多患者出现不同程度的肢体和语言功能障碍，甚至死亡。
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一个多功能分泌型蛋白家族，是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员之一。BMP的名字与其促进胚胎骨骼形成作用相关。BMP 家族的蛋白结构是高度保守，目前在人体内已确认的BMP家族成员达20多个。除了参与胚胎与骨骼生成，BMP家族蛋白在肌肉形成、血细胞生成、神经发育的过程中均具有复杂而多样的功能。一般而言， BMP是由BMP蛋白特异性膜结合受体介导，通过激活Smad家族，进而激动下游的MAPKs途径进行信号转导，对靶细胞产生作用。
目前，有越来越多的证据证实BMP在心脑血管疾病的发生发展中起到重要作用。已有研究表明，BMP 家族的蛋白质在脑缺血损伤中具有重要意义，在缺血导致的神经损伤、凋亡与再生，血脑屏障的维持与破坏，神经炎症的诱导与调控等病理生理过程都发挥重要的作用。在本博士论文中，我们主要针对一个新的BMP家族成员（骨形态发生蛋白内皮调节蛋白，BMP binding endothelial regulator，缩写BMPER）在脑缺血导致的神经损伤中的潜在作用开展研究。BMPER是一种拮抗骨形态发生蛋白信号转导的蛋白，可以导致内皮细胞分化，是BMP家族蛋白发挥信号转导活性所必需的调节分子。已有研究表明，像其他 BMP 家族蛋白一样，BMPER 在内皮细胞功能和血管形成中也起重要作用。此外，BMPER除了在血管发育中发挥重要作用外，还可促进内皮炎症和动脉粥样硬化的进展。
根据已有的BMP在脑缺血中重要作用的报道，以及BMPER与BMP家族其他成员之间的密切相互作用，我们推测BMPER与脑缺血之间存在密切的联系，并进行了以下实验来验证我们的想法。
目的：（1）观察BMPER是否在神经缺血状态下被诱导；（2）BMPER在小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型上是否具有神经保护作用；（3）BMPER在体外原代神经元缺氧缺糖复氧（OGD/R）模型上是否具有神经保护作用；（4）在细胞模型上深入探索BMPER发挥脑缺血保护作用的分子机制。
方法：（1）使用ELISA检测MCAO小鼠术后8小时、48小时、5天三个时间点血中BMP家族蛋白（BMP2、BMP4、BMP5、BMP7和BMPER）的浓度变化，与假手术Sham组小鼠进行比较；分离Sham小鼠和MCAO小鼠的脑组织，检测核心区、半暗带、对侧未缺血脑区脑组织中BMPER的mRNA表达量；OGD模型培养4或8小时，检测神经元细胞中BMPER的mRNA表达。（2）采用小鼠MCAO模型，分为3组：Sham组、MCAO+saline组、MCAO+BMPER治疗组；BMPER给药剂量为50μg/kg。检测指标包括：生存曲线、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC 染色，用于评价脑梗死体积）、神经功能评分（评价脑缺血损伤后神经功能损伤）、脑水肿、TUNEL免疫组化染色、caspase-3 活力、caspase-8 活力、caspase-9 活力、Iba 免疫组化染色、CD11b免疫组化染色、缺血侧脑组织的TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA表达水平、体重恢复曲线（3天、5天、7天3个时间点）。（3）采用OGD/R模型，分为3组：对照组、OGD/R组、OGD/R+BMPER治疗组，检测神经元存活数目、细胞活力和细胞凋亡。BMPER给药浓度设定为1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml，通过实验探索最佳给药浓度。（4）神经元OGD/R模型1小时复氧24小时后使用WB测定p-Smad1、p-Smad2和p-Smad3、p-Akt以及Nrf2和p-Nrf2的表达水平。另DHE测定细胞ROS水平，MDA试剂盒测定细胞脂质氧化情况，WB测定神经元细胞内Bax和Bcl-2蛋白表达水平。
结果：（1）小鼠MCAO术后8小时，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7和BMPER全部上调；在48小时点，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7都基本回到基线，只有BMPER依然增高；在术后5天，依然可以在MCAO小鼠上发现很高的血BMPER浓度。MCAO组小鼠的脑梗死核心区和梗死半暗带的BMPER的mRNA表达在8小时和24小时两个时间点都有明显的上调；在MCAO组小鼠的未缺血脑区，可以看到8小时时间点与Sham组无明显变化，但在24小时时间点，MCAO组小鼠的BMPER的表达有了轻微的上调，结果具有统计学差异。离体神经元OGD模型培养4或8小时，同样检测到神经元细胞中BMPER的mRNA表达明显上调。（2）生存曲线显示：3个剂量分别为5μg/kg、50μg/kg、100μg/kg的BMPER给药情况下，5μg/kg没有降低死亡率，而50μg/kg、100μg/kg都可明显降低死亡率。所以后续实验选定给药剂量为50μg/kg。MCAO 24小时后的TTC染色结果显示BMPER可以显著缩小脑梗死体积；称重实验结果显示 BMPER 可以显著减轻脑水肿程度；神经功能评分结果显示显示BMPER可以显著减轻神经功能缺损；TUNEL免疫组化染色结果显示BMPER可以显著减少神经凋亡；BMPER可以显著降低caspase-3、caspase-8的激活；Iba免疫组化染色结果显示 BMPER 抑制星型胶质细胞的激活；BMPER 抑制了缺血侧脑组织的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达上调；CD11b免疫组化染色显著增强，但是BMPER给药对其无明显影响；体重恢复曲线结果提示，在MCAO术后的3天、5天、7天三个时间点，BMPER给药组的体重恢复情况明显好于对照组。（3）OGD/R 1小时复氧24小时后神经元细胞计数结果显示10 ng/ml、100 ng/ml浓度BMPER给药可使存活细胞数增加，但1 ng/ml与对照组比较并无统计学意义；使用 CCK-8测定细胞活力，结果显示1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml BMPER均可使细胞活力显著提高；使用TUNEL染色观察细胞凋亡情况，结果显示10 ng/ml、100 ng/ml浓度BMPER可使细胞凋亡减少，1 ng/ml组无效。（4）神经元OGD/R模型1小时复氧24小时，给予BMPER后磷酸化Smad1、Smad2表达水平下降，p-Smad3表达水平上升，p-Akt表达水平上升， p-Nrf2/Nrf2表达水平上调。使用DHE测定细胞ROS水平，结果显示1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml BMPER均可使细胞ROS水平下降；用MDA试剂盒测定细胞脂质氧化情况，结果显示100 ng/ml浓度的BMPER可以降低细胞脂质氧化水平，但1 ng/ml、10 ng/ml浓度组与对照组比较并无统计学意义；使用WB测定神经元细胞内Bax和Bcl-2蛋白表达水平，结果显示BMPER可以使bax蛋白表达水平下降、bcl2蛋白表达水平上调。
结论：在本研究中，我们利用整体动物MCAO模型和离体培养的神经元OGD/R模型针对一个全新BMP家族蛋白BMPER在脑缺血损伤中的潜在作用和分子机制开展了研究。结果显示，BMPER在体内外均有确切的发挥脑缺血损伤保护作用，其机制可能为通过激动 Smad3-Akt-Nrf2 信号通路抑制氧化应激、减少细胞凋亡。这一结果深化了对BMP家族成员在脑血管疾病中的重要作用的认识，也揭示了BMPER可能是脑缺血防治的干预新靶点，具有重要的科学意义和潜在的临床转化应用前景。
大脑血流供应障碍引起缺血、缺氧。缺血区的神经元由于氧气和能量缺乏导致不可逆性坏死、凋亡，出现相应神经功能缺损。缺血脑组织可产生氧化应激、炎症反应及释放大量具有神经毒性的兴奋性氨基酸，这些继发性改变都会进一步损害神经功能，导致暂时性或永久性的神经功能受损。当前，脑缺血的治疗药物非常有限。缺血性脑卒中急性期最有效的治疗药物是具有溶栓作用的重组组织型纤溶酶原激活剂（r-tPA）。r-tPA已在临床使用多年，但由于时间窗过短（4.5个小时之内），仅有不到5%的患者能够及时应用r-tPA治疗。此外，溶栓有增加继发性出血的风险，受凝血功能的影响，很多符合溶栓时间窗的脑梗死患者并不能使用r-tPA治疗，导致许多患者出现不同程度的肢体和语言功能障碍，甚至死亡。
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一个多功能分泌型蛋白家族，是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员之一。BMP的名字与其促进胚胎骨骼形成作用相关。BMP 家族的蛋白结构是高度保守，目前在人体内已确认的BMP家族成员达20多个。除了参与胚胎与骨骼生成，BMP家族蛋白在肌肉形成、血细胞生成、神经发育的过程中均具有复杂而多样的功能。一般而言， BMP是由BMP蛋白特异性膜结合受体介导，通过激活Smad家族，进而激动下游的MAPKs途径进行信号转导，对靶细胞产生作用。
目前，有越来越多的证据证实BMP在心脑血管疾病的发生发展中起到重要作用。已有研究表明，BMP 家族的蛋白质在脑缺血损伤中具有重要意义，在缺血导致的神经损伤、凋亡与再生，血脑屏障的维持与破坏，神经炎症的诱导与调控等病理生理过程都发挥重要的作用。在本博士论文中，我们主要针对一个新的BMP家族成员（骨形态发生蛋白内皮调节蛋白，BMP binding endothelial regulator，缩写BMPER）在脑缺血导致的神经损伤中的潜在作用开展研究。BMPER是一种拮抗骨形态发生蛋白信号转导的蛋白，可以导致内皮细胞分化，是BMP家族蛋白发挥信号转导活性所必需的调节分子。已有研究表明，像其他 BMP 家族蛋白一样，BMPER 在内皮细胞功能和血管形成中也起重要作用。此外，BMPER除了在血管发育中发挥重要作用外，还可促进内皮炎症和动脉粥样硬化的进展。
根据已有的BMP在脑缺血中重要作用的报道，以及BMPER与BMP家族其他成员之间的密切相互作用，我们推测BMPER与脑缺血之间存在密切的联系，并进行了以下实验来验证我们的想法。
目的：（1）观察BMPER是否在神经缺血状态下被诱导；（2）BMPER在小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型上是否具有神经保护作用；（3）BMPER在体外原代神经元缺氧缺糖复氧（OGD/R）模型上是否具有神经保护作用；（4）在细胞模型上深入探索BMPER发挥脑缺血保护作用的分子机制。
方法：（1）使用ELISA检测MCAO小鼠术后8小时、48小时、5天三个时间点血中BMP家族蛋白（BMP2、BMP4、BMP5、BMP7和BMPER）的浓度变化，与假手术Sham组小鼠进行比较；分离Sham小鼠和MCAO小鼠的脑组织，检测核心区、半暗带、对侧未缺血脑区脑组织中BMPER的mRNA表达量；OGD模型培养4或8小时，检测神经元细胞中BMPER的mRNA表达。（2）采用小鼠MCAO模型，分为3组：Sham组、MCAO+saline组、MCAO+BMPER治疗组；BMPER给药剂量为50μg/kg。检测指标包括：生存曲线、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC 染色，用于评价脑梗死体积）、神经功能评分（评价脑缺血损伤后神经功能损伤）、脑水肿、TUNEL免疫组化染色、caspase-3 活力、caspase-8 活力、caspase-9 活力、Iba 免疫组化染色、CD11b免疫组化染色、缺血侧脑组织的TNF-αmRNA、IL-6 mRNA、IL-1βmRNA表达水平、体重恢复曲线（3天、5天、7天3个时间点）。（3）采用OGD/R模型，分为3组：对照组、OGD/R组、OGD/R+BMPER治疗组，检测神经元存活数目、细胞活力和细胞凋亡。BMPER给药浓度设定为1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml，通过实验探索最佳给药浓度。（4）神经元OGD/R模型1小时复氧24小时后使用WB测定p-Smad1、p-Smad2和p-Smad3、p-Akt以及Nrf2和p-Nrf2的表达水平。另DHE测定细胞ROS水平，MDA试剂盒测定细胞脂质氧化情况，WB测定神经元细胞内Bax和Bcl-2蛋白表达水平。
结果：（1）小鼠MCAO术后8小时，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7和BMPER全部上调；在48小时点，BMP2、BMP4、BMP5、BMP7都基本回到基线，只有BMPER依然增高；在术后5天，依然可以在MCAO小鼠上发现很高的血BMPER浓度。MCAO组小鼠的脑梗死核心区和梗死半暗带的BMPER的mRNA表达在8小时和24小时两个时间点都有明显的上调；在MCAO组小鼠的未缺血脑区，可以看到8小时时间点与Sham组无明显变化，但在24小时时间点，MCAO组小鼠的BMPER的表达有了轻微的上调，结果具有统计学差异。离体神经元OGD模型培养4或8小时，同样检测到神经元细胞中BMPER的mRNA表达明显上调。（2）生存曲线显示：3个剂量分别为5μg/kg、50μg/kg、100μg/kg的BMPER给药情况下，5μg/kg没有降低死亡率，而50μg/kg、100μg/kg都可明显降低死亡率。所以后续实验选定给药剂量为50μg/kg。MCAO 24小时后的TTC染色结果显示BMPER可以显著缩小脑梗死体积；称重实验结果显示 BMPER 可以显著减轻脑水肿程度；神经功能评分结果显示显示BMPER可以显著减轻神经功能缺损；TUNEL免疫组化染色结果显示BMPER可以显著减少神经凋亡；BMPER可以显著降低caspase-3、caspase-8的激活；Iba免疫组化染色结果显示 BMPER 抑制星型胶质细胞的激活；BMPER 抑制了缺血侧脑组织的TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达上调；CD11b免疫组化染色显著增强，但是BMPER给药对其无明显影响；体重恢复曲线结果提示，在MCAO术后的3天、5天、7天三个时间点，BMPER给药组的体重恢复情况明显好于对照组。（3）OGD/R 1小时复氧24小时后神经元细胞计数结果显示10 ng/ml、100 ng/ml浓度BMPER给药可使存活细胞数增加，但1 ng/ml与对照组比较并无统计学意义；使用 CCK-8测定细胞活力，结果显示1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml BMPER均可使细胞活力显著提高；使用TUNEL染色观察细胞凋亡情况，结果显示10 ng/ml、100 ng/ml浓度BMPER可使细胞凋亡减少，1 ng/ml组无效。（4）神经元OGD/R模型1小时复氧24小时，给予BMPER后磷酸化Smad1、Smad2表达水平下降，p-Smad3表达水平上升，p-Akt表达水平上升， p-Nrf2/Nrf2表达水平上调。使用DHE测定细胞ROS水平，结果显示1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml BMPER均可使细胞ROS水平下降；用MDA试剂盒测定细胞脂质氧化情况，结果显示100 ng/ml浓度的BMPER可以降低细胞脂质氧化水平，但1 ng/ml、10 ng/ml浓度组与对照组比较并无统计学意义；使用WB测定神经元细胞内Bax和Bcl-2蛋白表达水平，结果显示BMPER可以使bax蛋白表达水平下降、bcl2蛋白表达水平上调。
结论：在本研究中，我们利用整体动物MCAO模型和离体培养的神经元OGD/R模型针对一个全新BMP家族蛋白BMPER在脑缺血损伤中的潜在作用和分子机制开展了研究。结果显示，BMPER在体内外均有确切的发挥脑缺血损伤保护作用，其机制可能为通过激动 Smad3-Akt-Nrf2 信号通路抑制氧化应激、减少细胞凋亡。这一结果深化了对BMP家族成员在脑血管疾病中的重要作用的认识，也揭示了BMPER可能是脑缺血防治的干预新靶点，具有重要的科学意义和潜在的临床转化应用前景。