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背景与目的目前非甾体抗炎药(Non-Steroid Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs)被广泛应用于临床,但在发挥治疗作用的同时,也可导致上消化道及肠道黏膜不同程度的损伤。60%～70%的NSAIDs相关肠病患者无特征性的症状,严重的并发症如消化道大出血、肠道狭窄、肠穿孔等少见,但一旦发生,却是致命性的。在NSAIDs相关胃黏膜损伤中,环氧合酶起着关键性作用。但研究认为环氧合酶的抑制在NSAIDs相关肠黏膜损伤过程中并不起主要作用。目前,NSAIDs目关肠黏膜损伤机制尚无定论,较为认可的是“三次打击假说”。假说提出肠黏膜上皮屏障的完整性在NSAIDs相关肠病中至关重要。肠上皮屏障由上皮细胞及细胞间紧密连接构成。上皮细胞再生的速度为脱落速度的一半,这就决定了细胞脱落后间隙的存在。脱落细胞间隙与肠黏膜屏障之间有密切的关系。已有研究证实脱落细胞间隙密度可预测炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)的严重程度及其与复发之间的关系。本研究应用共聚焦激光显微内镜(Confocal laser endomicroscopy,CLE),观察吲哚美辛相关小肠上皮屏障损伤的脱落细胞间隙密度,并分析其发生机制,同时研究替普瑞酮和雷贝拉唑对上皮屏障的保护机制。材料及方法第一部分：NSAIDs相关小肠黏膜损伤及其药物干预的形态学研究雄性Wistar大鼠,按体重完全随机分为八组,每组6只,分别为健康对照组、模型组(采用吲哚美辛造模)、替普瑞酮预防组、雷贝拉唑预防组、治疗对照组、替普瑞酮治疗组、雷贝拉唑治疗组,以及替普瑞酮与雷贝拉唑联合治疗组(联合治疗组)。各组模型制备成功后水合氯醛腹腔注射麻醉成功后,沿十二指肠向下约10cm,取上段空肠,沿肠系膜对侧纵行剖开肠管,切口长约1-2cm,注意保护肠管的血流。暴露要观察的黏膜后心内注射荧光素钠注射液1min后用观察。将黏膜平铺开,将optiscan FIVE1探头垂直,轻柔放置于黏膜表面,观察时间控制在20min内。选择图像质量佳的5个图像,计数1000个上皮细胞中脱落细胞间隙数。观察结束后取小肠上段组织块长约1cm,冲洗掉表面血迹及粘液,立即10%中性甲醛固定12h后,沿肠系膜对侧剖开肠管,大头针固定于薄板上,尽量展平肠管,继续放入中性甲醛中固定12h。固定后的组织脱水后,蜡块包埋,切片厚度4um,苏木素-伊红(Hematoxylin and Eosin, HE)染色后观察。取空肠上段组织块,扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy, SEM)下观察黏膜表面超微结构。所有数据应用SPSS13.0统计软件分析。数据以x±s表示,多样本间两两比较检验方差齐性,两两组间采用LSD-t检验,方差不齐时两两组间比较采用Hamhane’s T2检验。P<0.05为差异有统计学意义。第二部分：NSAIDs相关小肠黏膜损伤及其药物干预的分子机制研究雄性Wistar大鼠,按体重完全随机分为八组,每组6只,分别为健康对照组、模型组(采用吲哚美辛造模)、替普瑞酮预防组、雷贝拉唑预防组、治疗对照组、替普瑞酮治疗组、雷贝拉唑治疗组,以及替普瑞酮与雷贝拉唑联合治疗组(联合治疗组)。各组模型制备成功后水合氯醛腹腔注射麻醉成功后,心内穿刺抽取血,离心后取上清,按照酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒指示测定血清肿瘤坏死因子-a (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)浓度；沿十二指肠向下约10cm,取小肠上段组织,剥取黏膜层提取蛋白,用蛋白免疫印迹(Western Blotting, WB)方法测定组织中caspase-3及核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)表达及组织中闭合蛋白(occludin)、闭锁小带蛋白1(Zonula occludens protein1, ZO-1)的表达。应用SPSS13.0统计软件分析数据。数据以x±s表示,多样本间比较检验方差齐性,两两组间采用LSD-t检验,方差不齐时两两组间比较采用Hamhane’sT2检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果第一部分：1.CLE脱落细胞间隙脱落细胞间隙呈强荧光,较吸收细胞略小,部分可见射流样征象。替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组空肠组织的脱落细胞间隙密度分别为(57.43±24.55)/1000和(59.80±21.14)/1000,均低于模型组的(110.93±50.58)/1000,差异均有统计学意义(t=53.50、54.13,P均<0.01)。联合治疗组的脱落细胞间隙密度为(40.53±15.39)／1000,低于治疗对照组的(93.80±40.65)/1000,差异有统计学意义(t=44.27,P<0.01)。2.HE病理学及SEM脱落细胞间隙组织固定后HE病理组织学观察,亦可见脱落或正在脱落的细胞,但脱落细胞间隙很少能观察到。扫描电镜下脱落细胞间隙清晰可见,呈空洞样,周围可见小肠上皮吸收细胞,与共聚焦激光显微内镜下表现类似。第二部分：1.血清TNF-α浓度替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的TNF-α水平分别为(25.80±8.97)和(22.74±7.15) ng/L,均低于模型组的(44.48±7.42) ng/L,差异均有统计学意义(t=18.68、21.74,P均<0.01)。联合治疗组TNF-α水平为(13.66±4.98)ng/L,低于治疗对照组的(24.67±6.70)ng/L,差异有统计学意义(t=9.02,P<0.01)。2. caspase-3及NF-κB含量替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的caspase-3水平分别为1.47±0.35和1.58±0.34,NF-κB水平分别为1.27±0.14和1.21±0.10,与模型组(2.44±0.45和1.69±0.13)相比,差异均有统计学意义(t=0.97、0.86、0.42、0.48,P均<0.01)。联合治疗组的caspase-3和NF-κB水平分别为0.66±0.06和0.44±0.21,低于治疗对照组,差异均有统计学意义(t=0.34、0.56,P均<0.01)。3. occludin及ZO-1表达替普瑞酮预防组和雷贝拉唑预防组的occludin水平分别为0.69±0.16和0.74±0.11,ZO-1水平分别为0.81±0.08和0.84±0.12,与模型组(0.45±0.22和0.64±0.07)相比,差异均有统计学意义(t=0.24、0.29、0.17、0.21,P均<0.01)。联合治疗组的occludin和ZO-1水平分别为2.50±0.46和1.76±0.18,高于治疗对照组,差异均有统计学意义(t=1.50、0.76,P均<0.01)。结论1.共聚焦激光显微内镜可以清晰地观察肠上皮脱落细胞间隙并进行密度测定,脱落细胞间隙密度可作为预测炎症反应程度及上皮屏障功能以及评价药物疗效的有价值指标。2.TNF-α增加通过NF-κB-caspase-3途径导致紧密连接蛋白occludin和ZO-1表达的减少是导致吲哚美辛相关小肠黏膜损伤过程中细胞脱落加速的机制之一。3.替普瑞酮与雷贝拉唑可以抑制TNF-α增加,通过NF-KB-caspase-3途径,改善细胞紧密连接蛋白的表达,改善肠上皮屏障的损伤,从而达到预防和治疗吲哚美辛相关小肠黏膜损伤的作用。研究意义本研究证实共聚焦激光显微内镜可以清晰得观察肠上皮脱落细胞间隙并进行脱落细胞间隙密度的测定,从而客观得评价吲哚美辛相关小肠黏膜的损伤,将来有望将其运用于临床,用于肠道炎症严重程度的评价,成为一种在体检测肠上皮细胞屏障完整性的新方法及评价药物疗效的新指标。雷贝拉唑和替普瑞酮可以抑制TNF-α增加,通过调节NF-κB-caspase-3途径,改善细胞紧密连接蛋白的表达,改善肠上皮屏障的损伤,从而达到预防和治疗吲哚美辛相关小肠黏膜损伤的作用。这为两种药物在NSAIDs所致小肠黏膜损伤治疗的临床应用提供动物实验佐证。