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第一部分目的大量流行病学调查表明,长期摄入砷化物可引起多种癌症,其中最常见的是皮肤癌、肺癌和膀胱癌,因此,砷化物已被国际癌症协会确认为人类确定致癌物。本研究以低浓度NaAsO2慢性处理人永生化角质形成细胞株(HaCaT),建立砷诱导体外细胞恶性转化模型,为砷致癌的分子机制研究提供技术手段。方法1、细胞培养HaCaT细胞株在5%CO2、37℃条件下常规培养于完全培养基,隔日换液,待细胞进入对数生长期后,用胰蛋白酶-EDTA消化传代。2、确定诱导剂量采用MTT法测各种浓度NaAsO2对细胞增殖能力的影响,根据其结果确定诱导剂量。3、细胞处理根据MTT实验结果确定最佳诱导剂量为0.05ppm,配制2.0mM浓度的NaAsO2溶液,在每次细胞换液时按比例加入培养瓶中,以保证细胞长期暴露于0.05ppm的NaAsO2溶液中,同时设立对照组即Oppm进行同步培养和传代。4、细胞形态的观察细胞培养期间,在倒置显微镜下观察每代细胞形态的变化并采集图片。5、流式细胞术检测转化细胞的细胞周期选NaAsO2处理第0,15,25代三组细胞测定细胞周期。6、细胞增殖能力测定收集Oppm和0.05ppm NaAsO2处理的对数生长期细胞,用MTT法测定其增殖能力。7、软琼脂集落形成实验0.6%Agar以0.5ml/每孔铺于24孔板,置37℃培养箱待用,取0.3%Agar与细胞悬液混匀,以0.5ml/每孔加入已铺好下层琼脂的24孔板,实验组与对照组均设置复孔,放置培养箱中培养,3周内每天观察细胞生长情况并采集图片。8、裸鼠皮下致瘤实验将NaAsO2处理第25代和第30代及对照组的的25代和第30代的HaCaT细胞按2×106/0.2ml密度注射于Balb/c裸鼠右侧腋窝皮下,定期观察肿瘤形成及将肿瘤组织取出,测量肿瘤体积并作组织切片、HE染色后进行病理学鉴定。结果1、低浓度NaAsO2慢性处理所致细胞生物学特性变化0.05ppmNaAsO2处理的HaCaT细胞传代培养.30代以后,细胞形态和生长方式均发生明显改变,增殖能力旺盛,倍增时间明显缩短。2、低浓度NaAsO2慢性处理所致细胞恶性转化和致瘤性0.05ppm NaAsO2所致恶性转化HaCaT细胞能在软琼脂培养基上形成集落,且能在裸鼠皮下形成肿瘤；肿瘤组织病理学切片显示：恶性转化HaCaT细胞形成低分化鳞癌。从而说明低浓度砷化物慢性处理可引起HaCaT细胞恶性转化并具有致瘤性。结论1、低浓度NaAsO2慢性处理可使HaCaT细胞生物学特性发生改变。2、低浓度NaAsO2慢性处理可引起HaCaT细胞发生恶性转化且具有致瘤性。第二部分目的：探讨肿瘤干细胞标志物CD44V6在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞HACAT转化过程中的表达及意义。方法：分别对第0,5,10,15,20,25,30代低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞和同期配对的对照组HaCaT细胞滴片及裸鼠成瘤组织切片进行荧光免疫组化染色；同时提取上述不同时间点两组细胞的总蛋白,利用蛋白印迹(Western blotting)等实验技术对可能存在的肿瘤干细胞标志物进行筛选。结果：长期低浓度NaAsO2处理的HaCaT细胞中,肿瘤干细胞标志物CD44v6蛋白含量有逐渐增加的表现；对照组CD44v6蛋白含量未发现明显变化。恶性转化的HaCaT细胞(第25代)其CD44v6蛋白含量比同期对照组HaCaT细胞(第25代)显著增加(P<0.05)。NaAsO2处理组HaCaT细胞在15代后,CD44v6阳性表达显著增加,定位于细胞膜,在25代和30代约有8%的阳性率。CD44v6在肿瘤组织细胞中阳性表达率约为50%(++)；而肿瘤外组织细胞未发现有CD44v6表达。结论：长期低水平砷暴露所致皮肤损伤或癌组织中可能存在及少数的具有自我更新能力、分化潜能的癌干细胞,而CD44v6是其潜在的特异性分子标志物。