论文部分内容阅读
创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）是神经外科最常见的一种疾病,其死亡率、致残率居各类创伤之首。脑伤后以细胞凋亡为主要特征的继发性脑损伤是影响伤情转归的主要因素。载脂蛋白E基因（apolipoprotein E, APOE）主要有ε2、ε3、ε4三个等位基因,我们前期工作和国外研究显示,携带ε4的患者对脑损伤的耐受性降低,更易出现伤情加重及不良预后。但是,APOE影响脑损伤病情转归的机制尚未阐明。Ca2+超载是细胞死亡的“最终共同通路”,Ca2+超载实质是细胞内外离子失衡的结果。K+是维持细胞内离子环境最主要的阳离子,目前认为钾通道也是细胞凋亡的重要环节之一。本课题以APOE亚型特异性与延迟整流钾通道的关系作为切入点,构建人源性ε2、ε3、ε4的真核表达载体,分别转染APOE敲除鼠胚神经干细胞（neural stem cells, NSCs）,筛选稳定表达细胞株,建立神经元/胶质细胞共培养划痕损伤模型,采用流式细胞技术及膜片钳技术分析伤后APOE亚型特异性与细胞早期凋亡、延迟整流钾通道的关系,探讨APOE影响继发性神经细胞损伤的作用机制。一、人源性APOE基因真核细胞表达载体的构建和鉴定人源胎脑组织中提取Total RNA后,设计引物调取APOEε3基因CDS区域,克隆至pMD19-T simple载体中并测序验证,采用定点突变技术,得到APOEε2及APOEε4的重组突变体载体。EcoR I/BamH I双酶切切下编码APOE的片段,插入真核表达载体pEGFP-N1。对重组质粒进行双酶切、PCR和测序验证后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组质粒转染至真核细胞（293-T细胞）中,用荧光显微镜观察基因在239-T细胞中的表达情况。结果:双酶切、PCR和质粒测序结果证明APOE各等位基因正确地克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,并能在293-T真核细胞中进行融合表达。结论:成功构建了人源性pEGFP-N1-APOE各亚型的真核表达载体,并成功转染真核细胞,为下一步实验中各重组质粒转染APOE敲除鼠的NSCs奠定了基础。二、稳定表达pEGFP-N1-APOE的神经干细胞克隆的建立和鉴定采用APOE敲除鼠（E15d）的胎鼠脑组织为细胞来源,常规分离,培养和鉴定所得到的NSCs。将前期构建好的人源性APOE各等位基因重组质粒以阳离子脂质体Lipofectamine 2000转染至NSCs中,在含有200μg/ml G418培养液中培养14d,以筛选稳定表达pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。将稳定表达的细胞克隆进行单细胞克隆培养以纯化稳定表达人源性APOE各等位基因的NSCs。扩增稳定表达目的基因的NSCs,用RT-PCR、Western Blot、激光共聚焦显微镜检测目的基因在转基因NSCs中的表达情况。结果:成功将前期构建的人源性APOE各重组质粒转入APOE敲除鼠NSCs,经检测证明稳定表达EGFP的NSCs可表达人APOE各等位基因。结论:采用阳离子脂质体法可有效地将APOE各重组质粒转染到NSCs,经过G418筛选后可以获得稳定表达pEGFP-N1-APOE的NSCs克隆。三、APOE亚型特异性对神经细胞伤后早期凋亡的影响本实验采用稳定表达人APOE各等位基因的APOE敲除鼠NSCs,优化诱导分化条件,构建神经元/胶质细胞共培养体系。控制条件,利用微量移液器枪头切割培养的神经元、胶质细胞,造成神经细胞机械性损伤,构建细胞划痕损伤模型。参考文献及预实验结果设置时间点（6h、12h、24h、48h）,通过Annexin V/PI联合流式细胞技术检测损伤后各组细胞早期凋亡率,分析人APOE各等位基因影响继发性神经细胞损伤的差异。结果:成功构建携带人源性APOE各等位基因的细胞划痕损伤模型;伤后各时间点均能检测到早期凋亡细胞,24h时间点各组细胞早期凋亡率较6h、12h明显增高,有显著性差异（P<0.05）,且人APOEε4组及鼠APOE（?）组较其余组早期凋亡率明显增高,有显著性差异（P<0.05）。结论:转染人APOEε4的细胞早期凋亡率高于其他组,从细胞水平为APOE多态性影响TBI病情及预后的临床研究结果提供了实验依据。四、APOE亚型特异性影响神经细胞早期凋亡的机制探讨以APOE亚型特异性与延迟整流钾通道相关性作为切入点,采用膜片钳技术检测各实验组延迟整流钾电流（ID）的差异。选择边缘清晰、大小相似的神经元样细胞作为实验对象,记录致伤前后ID情况,并进行组间比较,进一步探讨APOE影响神经细胞早期凋亡的病理机制。结果:（1）依据电生理特性证实各细胞组所记录到的外向电流为ID。且发现未受伤状态下各组神经细胞的ID无明显差异（p>0.05）。（2）在机械损伤后,各组神经细胞的ID均明显增加,但是人APOEε4组与鼠APOE（-）组抑制神经细胞ID幅度增加的作用较其余组明显（p<0.05）。结论:APOEε4对伤后神经细胞的ID抑制作用更明显,造成APOEε4细胞内Ca2+超载较APOEε2和APOEε3细胞严重,这可能是其影响TBI后病情转归及预后的机制之一。