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手性γ-内酰胺是一种重要的化学医药合成前体,可以用于合成抗AIDS和抗流感病毒的药物阿巴卡伟和帕拉米韦。生物法制备光学纯γ-内酰胺具有立体选择性高、反应条件温和等特点,为生产手性医药化合物提供一条绿色合成途径。前期工作表明,Delftia sp.CGMCC 5755可应用于对映选择性水解外消旋γ-内酰胺,利用全细胞催化100 g·L–1外消旋底物,取得转化率和底物对映选择性(ees)分别为53.7%和99.9%。本研究在此基础上,对该菌株来源的(+)-γ-内酰胺酶进行异源表达,以解决野生菌发酵成本高,发酵周期长的缺点。以Delftia acidovorans SPH-1基因组数据为参考,“acetamidase/formamidase/arylformamidase”为关键词,检索到5个潜在的γ-内酰胺酶编码基因。对这5个基因(lm1,lm2,lm3,lm4和lm5)进行异源克隆表达,lm2和lm3编码的蛋白(氨基酸序列相似度约为85%)具有(+)-γ-内酰胺酶活性,但酶活较低,主要因为在T7启动子调控下大部分酶蛋白以包涵体的形式存在,将其中酶活较高的内酰胺酶基因lm3命名为delm。尝试了不同的可溶性策略,以增加其编码(+)-γ-内酰胺酶De Lm的活性表达。通过诱导温度和培养基优化,De Lm蛋白酶活没有显著提高。选择T5启动子,降低转录水平,De Lm可溶性表达没有显著提高。利用融合蛋白Nus A和MBP可以改善De Lm的可溶性表达,但MBP融合表达后,重组酶丧失(+)-γ-内酰胺酶活力;采用Nus A标签后,重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET43a-delm的比活力提高到1.02U·gDCW–1。分子伴侣(Gro ES-Gro EL,Dna K-Dna J-Grp E,Tig等)对本研究中的De Lm蛋白的可溶性没有促进作用。进一步考察以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168为宿主异源表达De Lm的效果。构建了重组菌B.subtilis 168/p MA5-delm,酶活检测表明,该重组细胞破碎液酶活达1.62U·gDCW–1,比重组大肠杆菌活力提高58%,且重组菌B.subtilis全细胞具有(+)-γ-内酰胺酶活性。SDS-PAGE分析,异源蛋白在B.subtilis中表达量虽有下降,但没有包涵体生成。对重组B.subtilis对映选择性水解γ-内酰胺的全细胞反应条件进行了优化,最适反应温度、p H、搅拌转速分别为30°C、9.0和300 r·min–1。当底物浓度达到250 g·L–1时,全细胞催化反应仍未受到底物抑制作用,表观最大反应速率Vmax和亲和性常数Km分别为0.595 mmol·min–1·gDCW–1和378 mmol·L–1(约41 g·L–1)。将重组B.subtilis应用于制备光学纯(-)-γ-内酰胺,在最适反应条件下,500 m L反应体系中添加5 g细胞和50 gγ-内酰胺底物,反应22.5 h后,转化率和ee分别为55.2%和98.6%。利用等体积二氯甲烷萃取反应液三次,将有机相合并,经干燥和减压蒸馏后最终获得14 g(-)-γ-内酰胺,回收率为56%,HPLC检测纯度为99%。本研究为利用重组枯草芽孢杆菌全细胞制备光学纯(-)-γ-内酰胺提供了实验依据和理论指导。