目的: 胎儿是同种异基因产物，它携带被母体认为是外源的父系MHC分子，但却能抵御母体免疫细胞的攻击并在妊娠中存活，这其中的机制至今仍不十分清楚。八十年代末，Starkey和King发现妊娠子宫中有大量CD56brightNK细胞，其特殊的分布状态和功能使人们认识到子宫NK细胞可能参与了胚胎的植入和母胎界面免疫平衡的维持。尽管目前对这个过程中的许多环节尚不清楚，但已初步证实，子宫NK细胞(uNK细胞)的数量或功能失调与病理性妊娠(如流产和先兆子痫等)密切相关。研究uNK细胞在妊娠中的分布与机能，探讨妊娠期外周血NK细胞(pNK细胞)和uNK细胞生物学特性的差异，揭示uNK细胞在子宫微环境中的生理功能及其对母胎界面免疫平衡网络的影响，有利于人们进一步认识妊娠这一生理过程，并为临床最终治疗病理性妊娠提供了新的思路。 本实验以妊娠早期pNK细胞、uNK细胞、蜕膜组织与滋养层组织作为主要的研究对象，达到以下研究目的： 1.研究妊娠子宫微环境中uNK细胞表面NKG2A和NKG2D及其相应配体的表达，探讨NKG2A与NKG2D的不平衡表达在母胎界面免疫耐受形成中的作用。 2.研究妊娠期子宫微环境中子宫NK细胞的生物学特性，探讨uNK细胞与周围的蜕膜组织及滋养层组织的生理功能及相互作用，比较妊娠子宫NK细胞与外周血NK细胞在生理学功能上的差异。 方法: 1.选择30例孕6～9周的正常妊娠妇女，分离其新鲜蜕膜组织，除去绒毛，分离蜕膜和外周血淋巴细胞，采用流式细胞仪测定NK细胞在蜕膜淋巴细胞和外周血淋巴细胞的分布及其表面NKG2A与NKG2D的表达，比较30例早孕妇女与30例未孕妇女外周血NK细胞表面NKG2A与NKG2D表达的差异；RT-PCR技术检测早孕妇女滋养层组织中HLA-EmRNA和MICAmRNA的表达。 2.无菌取早孕妇女新鲜蜕膜组织及外周血标本，除去蜕膜组织中的绒毛，分离蜕膜淋巴细胞，同时分离外周血淋巴细胞，免疫磁珠技术纯化uNK细胞与pNK细胞，流式细胞仪检测其纯度，MTT法检测uNK细胞与pNK细胞对K562的杀伤，效靶比分别为5：1，2.5：1，1.25：1，0.625：1。MTT法检测uNK细胞与pNK细胞在4h，24h，48h，72h和96h的增殖情况。RT-PCR技术检测uNK细胞与pNK细胞趋化、侵袭、促血管形成等生物学活性相关基因的转录水平，同时检测其相应配体在蜕膜组织和滋养层组织的表达状况。 结果: 1.妊娠子宫蜕膜淋巴细胞中NK细胞约占70％，流式细胞分析的结果显示，uNK细胞NKG2A的表达水平显著高于pNK细胞，分别为97.86％±1.75％与33.35％±10.92％(x-±s)，二者差异有显著性(P＜0.05)，在滋养层细胞中检测到其配体HLA-E的表达；而与pNK细胞相比，uNK细胞表面NKG2D的表达与之较为相近，分别为93.21％±4.52％与97.80％±1.72％，但二者仍有显著性差异(P＜0.05)，在滋养层组织未检测到其相应配体MICAmRNA的表达。未孕妇女pNK细胞表面NKG2A和NKG2D的表达分别为33.50％±8.45％与98.60％±1.18％，与早孕妇女相比无显著性差异(P＜0.05)。 2. 经CD56免疫磁珠处理后所获得的uNK细胞(CD56brightCD3-)与pNK细胞(CD56dimCD3-)纯度)95％。 2.1 MTT法检测uNK细胞与pNK细胞对K562细胞的杀伤活性，发现在效靶比为5：1，2.5：1，1.25：1，0.625：1的条件下，uNK细胞的杀伤活性远低于pNK细胞。 2.2 MTT法检测uNK细胞与pNK细胞在4h，24h，48h，72h和96h的增殖情况，发现uNK细胞的增殖活性略高于pNK细胞。 2.3 uNK细胞与pNK细胞均表达趋化因子受体CCR1，CCR5，CCR7，CXCR2，CXCR4和CX3CR1mRNA，且表达强度相近，其中CXCR4和CX3CR1mRNA的表达水平较高。 2.4 uNK细胞与pNK细胞均检测到VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-EmRNA的表达，uNK细胞还表达PIGF和Ang2mRNA，同时蜕膜组织可表达VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，Tie-1和Tie-2mRNA，但在滋养层组织中仅检测出VEGFR2和Tie-2mRNA的表达。 2.5 一些与血管形成相关的因子如homeoboxb3，COX-2，HIFα1，TGFβ1和TGFβ3mRNA也在uNK细胞与pNK细胞表达，iNOsmRNA仅在uNK细胞中检出。2.6uNK细胞还检测到TIMP-1，TIMP-2和TIMP-3mRNA的表达。此外，发现uNK细胞中还表达OPN，perforin，granzyme，TNFα和FasLigandmRNA。 结论 1.蜕膜中的淋巴细胞主要为NK细胞，其免疫学表型与pNK细胞有较大的区别，妊娠期uNK细胞表面高表达抑制性受体NKG2A，同时滋养层组织表达相应的配体HLA-E，这可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素。早孕妇女pNK细胞NKG2A和NKG2D的表达水平与未妊娠者相似，可见妊娠期pNK细胞NKG2A和NKG2D的表达较未妊娠时并无明显变化。此外，uNK细胞NKG2A的表达水平较pNK细胞显著升高，NKG2D的表达水平与之较为接近，提示uNK细胞与pNK细胞可能源于相同的前体细胞，由于二者的发育分化环境不同导致了表型和功能的差异。 2.妊娠期uNK细胞与pNK细胞的表型、增殖和杀伤活性有较大不同，其某些细胞因子及其受体的表达状况与妊娠早期uNK细胞在蜕膜中的募集和生理学功能有关。妊娠期外周血NK细胞在生理功能上与uNK细胞有较大相似性，它能产生多种生物活性因子，参予正常妊娠的维持，但与pNK细胞相比，uNK细胞有更强的促血管形成能力，因此被认为在母胎界面的血管重建中发挥重要功能。由此可见，uNK细胞是一群具有较强调节功能的NK细胞亚群，它通过表面受体(或配体)与蜕膜组织或滋养层组织表达的配体(或受体)相互作用，直接或通过分泌一系列细胞因子调控母胎界面的血管重建及胎盘与滋养层组织的生长和发育，并同时参与母胎界面的免疫耐受的维持，使胚胎得以顺利植入，它是维持胚胎正常发育的物质基础。