肿瘤细胞因为其异常的代谢速率和永生性往往导致细胞处于缺氧、代谢废物累积、营养物质缺乏的条件下,这种条件会破坏细胞内的蛋白质稳态不利于细胞生存,因此导致细胞应激。Hsp70蛋白是一类分子量为70 k Da的分子伴侣蛋白,在应激条件下提高表达量以维持细胞内蛋白质稳态,因此在肿瘤细胞中,Hsp70蛋白高表达以维持肿瘤细胞生存。Hsp70蛋白功能的正常发挥通过其变构循环实现,该循环消耗ATP为Hsp70蛋白稳定致癌客户蛋白和肿瘤抗凋亡信号通路提供能量。在变构循环中,Hsp70蛋白需要依赖一系列辅助分子伴侣蛋白的帮助。Bim蛋白是一个新近由本课题组发现的Hsp70辅助分子伴侣蛋白,通过其BH3结构域结合到Hsp70蛋白的类BH3沟槽中,Bim可以促进Hsp70的ATP酶活,同时可以稳定AKT等多种Hsp70的致癌客户蛋白和介导抗凋亡信号通路。因此,设计合成小分子破坏Hsp70-Bim的蛋白-蛋白相互作用是抗癌药研发的新策略。BH3模拟分子S1g-6可以解离Hsp70-Bim的相互作用,是本课题组研发的第一个特异性解离Hsp70-Bim的抑制剂。然而S1g-6分子的活性还有提高的空间。本研究基于S1g-6分子进行了一系列的分子优化,设计合成了A、B两个系列的分子,通过Hsp70的ATP酶活试验检测得到了活性明显提升的B2,B4,B5分子。构效关系分析发现,B2分子的6号位朝向的是一个宽而浅的疏水口袋,适合容纳如环戊硫醇和环己硫醇之类的环状硫醇;B2分子3号位朝向的是一个窄而短的较亲水的口袋,烷基胺取代基和该口袋可以很好的相互作用。以B2分子为活性分子进行了免疫共沉淀和细胞活性实验,结果发现,B2分子可以在细胞内解离Hsp70-Bim的蛋白-蛋白相互作用,B2分子对K562、U937等几种肿瘤细胞的杀伤活性是S1g-6分子的1.6倍-2.5倍。对B2分子和Hsp70蛋白进行了二维核磁滴定实验,根据二维核磁结果并结合分子对接研究确认了分子的结合位点和结合模式,B2分子结合在NBD结构域ⅠA和ⅡA之间一个缝隙中,靠近MKT-077分子的结合位点。Hsp70蛋白包含13种亚型,其中人们重点关注且广泛研究的是四种亚型:分布于细胞质的诱导型Hsp70和组成型Hsc70,分布于内质网的Grp78/Bip,分布于内质网的Grp75/Mortalin。这四种亚型有着各自的亚细胞定位,可以和不同的蛋白相互作用促进肿瘤细胞生存或者维持正常细胞的生理功能,例如Grp78调控的线粒体未折叠蛋白反应。这几种亚型在不同的肿瘤细胞中的表达含量也存在差异。因此,设计合成能够选择性抑制亚型Hsp70蛋白的抑制剂是特异性抗肿瘤所需要的。实现抑制剂分子的选择性的一个思路即是利用不同亚细胞定位的化学基团。本研究的第二部分内容以另一个BH3模拟分子S1g-2分子为起始分子,S1g-2分子也是一个Hsp70抑制剂,同S1g-6一样可以解离Hsp70-Bim二聚体,S1g-2分子含有一个可以修饰的酯基。对S1g-2分子连接linker,引入亚细胞定位基团设计合成了三个分子。利用激光共聚焦显微镜进行的分子细胞内共定位实验发现,S1g-ER分子和S1g-Mito分子可以定位到内质网和线粒体中,说明引入定位基团的成功。对三个分子在多种肿瘤细胞系中进行了活性筛选,各自确定了最优的作用细胞系。综上所述,本研究的第一部分内容优化得到了几个相比于起始分子结合Hsp70的活性明显提升的分子,并且确定了其结合位点和结合模式,为今后继续设计合成活性更优的分子提供了基础,为继续探究Hsp70-Bim的功能提供了分子工具;本研究第二部分内容得到的三个分子则为实现通过亚细胞定位,抑制Hsp70蛋白亚型进行了实验确证,为继续探究各Hsp70亚型在细胞中的功能研究提供了分子工具。