第一部分 外周血中内皮祖细胞的分离和培养 目的:研究外周血中内皮祖细胞分离、培养及和鉴定的方法。方法:从年轻志愿者的外周血中用密度梯度离心方法分离出单个核细胞,在添加VEGF的M199培养液中培养,每隔3～4d换一次液。培养5d后,消化贴壁细胞,用DiI—ac-LDL及FITC-UEA-1对其进行免疫荧光分析。结果:培养3～4d单核细胞开始贴壁,14d左右开始出现索条状结构,免疫荧光鉴定显示>90%的贴壁细胞呈双荧光染色阳性。结论:外周血中富含内皮祖细胞,在一定的培养条件下,可分化为内皮样细胞。 第二部分 雌激素对内皮祖细胞增殖和迁移作用的影响 目的 研究雌激素对内皮祖细胞增殖及迁移的影响及细胞培养时间和雌激素浓度对其影响,并研究雌激素作用下细胞周期变化和促细胞增殖和迁移的细胞表面抗原VE-cadherin,Flt-1和KDR mRNA和蛋白水平的变化。方法 从年轻志愿者的外周血分离出单个核细胞,在内皮细胞培养条件下培养,诱导,分化出内皮祖细胞。取培养7d的EPCs,并分别加入不同浓度(0,10^-6mol/L,10^-7mol/L,10^-8mol/L,10^-9mol/L或10^-10mol/L)的17β—雌二醇作用24h后,进行细胞增殖实验分析（MTS）和细胞迁移实验,观察不同浓度雌激素对内皮祖细胞增殖及迁移能力的影响。分别取4×10⁵培养5d,7d,9d,13d,20d的内皮祖细胞,加入10^-8mol/L雌激素作用24小时,消化贴壁细胞并在显微镜下计数。分别取培养5d,7d,9d,13d的内皮祖细胞,加入10^-8mol/L的雌激素作用24h后检测内皮祖细胞在细胞周期各时相的分布,进一步研究雌激素对细胞增殖的影响。分别取培养5d,7d,9d,13d的内皮祖细胞,加入10^-8mol/L的雌激素作用24h后,分别用Real-time和流式细胞技术检测内皮细胞表面特异性抗原Flt-1,KDR和VE-cadherin mRNA和蛋白水平表达的变化。结果 增殖实验MTS分析表明雌激素能显著增强内皮祖细胞的增殖活性,雌激素浓度为10^-8mol/L—10^-9mol/L时,增殖活性最强。手工计数内皮祖细胞显示雌激素作用后内皮祖细胞数目显著增多,8-10d的内皮祖细胞增殖活性达到高峰。迁移实验也表明雌激素能够促进内皮祖细胞的迁移,雌激素浓度