研究背景慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是一组进行性发展的慢性疾病群,其共同的特点是肾功能以不同速度进行性恶化,最终进展为终末期肾衰竭。肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰竭的共同途径,是决定肾脏疾病预后的主要因素。肾小管间质纤维化表现为淋巴单核细胞浸润、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在肾间质过度沉积以及肾小管萎缩缺失。炎症反应是肾间质纤维化的启动因子和病理基础,肾小管上皮细胞在各种致病因素作用下受损活化,表达释放趋化因子和生长因子,吸引炎症细胞浸润,分泌大量ECM,继而呈隐匿而累积性的细胞过度凋亡,导致肾小管萎缩缺失,是造成小管间质纤维化、肾功能进行性下降的主要原因。炎症是导致和加重肾小管间质纤维化,促进CKD进展的主要原因。C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是近年倍受关注的一种促炎症介质。传统观点认为CRP只是一种炎症标志物,但近年来研究发现,CRP本身也是一种炎症介质而主动参与了炎症和免疫反应过程。CRP作为主要的急性正时相蛋白,属于五聚体蛋白家族成员之一,在感染、炎症和组织损伤时的其血清浓度迅速增高。其生物学作用包括与单核巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞上的Fcγ受体结合激活受体,介导炎症反应,如上调粘附分子,诱导趋化因子产生,募集并激活循环单核细胞等炎症细胞。CRP还具有许多类似免疫球蛋白IgG的特性,CRP可以与特定配体结合,激活补体经典途径,加强吞噬细胞的调理作用等。研究表明,CKD随着肾功能的减退,机体出现慢性的全身性炎症反应,表现为循环CRP等正性急性时相反应物持续的低度增多,有学者称其为“微炎症状态”,CRP是慢性炎症的标志物。众多证据表明,CRP与慢性肾衰竭患者动脉粥样硬化和心血管病变等并发症密切相关。CRP是否对CKD的进展和肾纤维化产生影响仍不清楚,但已有某些证据提示CRP可能在CKD发展中起作用。有研究表明,循环中高水平的CRP能够与受损的肾组织细胞结合并沉积于包括肾小球、肾小管间质、管周微循环的肾组织中。CRP可诱导肾小球系膜细胞产生活性氧,促进单核细胞趋化蛋白-1表达,并可刺激远端肾小管上皮细胞激活MAPK转导通路,诱导合成分泌趋化因子RANTES,提示CRP具有活化损伤肾固有细胞的作用。慢性肾脏病患者随着肾功能的减退,往往出现CRP水平的持续升高,那么CRP作为一种促炎症介质是否反过来促进肾功能进一步恶化,导致CKD进行性发展?目前还不清楚。因此我们提出CPR可能进一步促进肾功能恶化的假设：慢性肾脏病时循环中增高的CRP通过受损的肾小球滤过膜,进入肾小管后与肾小管上皮细胞上相应受体结合,使肾小管上皮细胞受损活化,产生炎症和致纤维化介质,引起细胞外基质合成分泌增多,并诱导肾小管上皮细胞凋亡,从而促进了肾间质纤维化的发展,导致CKD的进行性发展。本研究首先从临床中观察分析CRP与CKD患者肾功能减退的关系。我们测定了不同时期CKD患者血和尿CRP水平,分析血和尿CRP水平与肾功能的关系,初步探讨CRP在慢性肾脏病进展中的潜在作用。然后以体外培养的人肾小管上皮细胞为靶细胞,观察CRP是否上调其受体-Fcγ受体表达,促进炎症和致纤维化因子的表达并导致细胞外基质分泌增多,以及CRP对肾小管上皮细胞凋亡的影响,从而阐述CRP在CKD进展发生中的作用和机制,为延缓慢性肾衰竭进行性恶化的防治提供新的治疗靶点。第一章C-反应蛋白与慢性肾脏病肾功能进展的关系目的：探讨CRP对CKD患者肾功能进展的影响。方法：入选56例尚未接受透析的CKD 3-5期住院患者。以CRP10 mg/L为分割点,将56例非透析CKD患者分为炎症组20例和非炎症组36例。血清和尿CRP水平采用免疫透射比浊法测定。肾小球滤过率(GFR)采用中国人简化MDRD公式计算。血清肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)采用酶学法测定。24小时尿蛋白测定用双缩脲法。放射免疫法测定血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)。根据CRP不同水平比较肾功能的差异并分析血和尿CRP水平与肾功能减退的相关性。结果：与非炎症组比较,炎症组GFR显著性降低,Scr.BUN升高(P均<0.01)。CRP、TNF-α、IL-6与GFR均呈负相关(r=-0.648、-0.375、-0.381,P<0.01)。CRP水平与IL-6、TNF-α水平呈正相关(r=0.391、0.471,P<0.01)。CKD 5期24小时尿CRP排泄量[4.42±2.65 mg／24h,95%可信区间(CI)2.52-6.31 mg/24h]CKD4期24小时尿CRP排泄量(1.45±1.38 mg/24h,95％CI 0.46-2.43 mg/24h),CKD3期24小时尿CRP排泄量(1.02±0.93 mg/24h,95％CI 0.36-1.68 mg/24h),均高于健康对照组24小时尿CRP排泄量(0.12±0.21 mg/24h,95％CI 0.01-0.21mg／24h)(所有P<0.008)。CKD 5期高于4期(P=0.004)和3期(P=0.015),CKD4期和3期比较无统计学差异。CKD患者24小时尿CRP与血CRP成正相关(r=0.707,P<0.001);与24小时尿蛋白成正相关(r=0.777,P<0.001),与GFR成负相关(r=-0.587,P：0.001)。尿CRP排泄量同时受血CRP和24小时尿蛋白水平的影响。结论：随着肾功能的减退而出现的慢性炎症状态,其标志物CRP与肾功能的减退密切相关。血清CRP及尿中CRP与肾小球滤过率成负相关,提示CRP本身作为一种重要的促炎介质有可能参与了CKD进展的发生。第二章C-反应蛋白对肾小管上皮细胞Fcγ受体表达的影响目的：以体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)为靶细胞,观察CRP对肾小管上皮细胞Fcγ受体表达的影响并鉴定Fcγ受体的亚型。方法：以CRP0、01、1、10μg/ml浓度干预HK-2细胞24h,采用RT-PCR和Real-timePCR分别检测FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡa(CD32a)、FcγRⅢ(CD16)受体mRNA表达。唯有FcγRⅡa(CD32a) mRNA表达。为进一步鉴定CRP对HK-2细胞表面FcγRⅡa表达的影响,HK-2细胞在10μg/ml CRP培养24h后,分别采用流式细胞术、激光共聚焦显微镜和Western blot法检测FcγRⅡa蛋白的表达水平。结果：1. Real-time PCR检测Fcγ受体mRNA的表达：HK-2细胞无FcγRⅠ(CD64)和FcγRⅢ(CD16)mRNA表达。唯有FcγRⅡa(CD32a)mRNA表达。FcγRⅡa(CD32a) mRNA表达呈剂量依赖性增高(P<0.001), CRP10μg/ml刺激达到高峰,上调了7.9倍。2. RT-PCR检测Fcγ受体mRNA的表达：HK-2细胞在10μg/ml CRP培养24h.HK-2细胞无FcγRⅠ和FcγRⅢmRNA表达。唯有FcγRⅡa mRNA表达。RT-PCR法扩增产物经琼脂糖电泳显示CRP上调FcγRⅡamRNA表达量。3.流式细胞术检测HK-2细胞FcγRⅡa的表达：CRP10μg/ml浓度刺激HK-2细胞24h后FcγRⅡa显著性上调。CRP组平均表达量23.35%±7.43%,未刺激组平均表达量1.66%±0.28%,差异有显著性(P<0.01)。4.激光共聚焦显微镜检测HK-2细胞FcγRⅡa的表达：CRP干预后HK-2细胞FcγRⅡa表达较未刺激组荧光显著性增强,FcγRⅡa分布在细胞膜。5. Western blot检测HK-2细胞FcγRⅡa的表达：CRP以剂量依赖方式上调FcγRⅡa表达,CRP 10μg/ml较未处理对照组上调FcγRⅡa表达平均4.2倍(P<0.001)。结论：人近端肾小管上皮细胞存在FcγRⅡa表达,CRP刺激可上调肾小管上皮细胞表面的FcγRⅡa受体的表达,提示CRP可以通过对FcγRⅡa的结构识别和功能活化介导生物学效应。第三章C-反应蛋白对肾小管上皮细胞促纤维化因子和炎症介质表达的影响目的：观察CRP刺激是否诱导肾小管上皮细胞致纤维化和炎症因了表达并导致ECM的积聚。方法：HK-2细胞分别与0、0.1、1、10、20μg/ml CRP共孵育24h;以10μg/ml CRP培养0、12、24、48h,采用ELISA测定细胞培养上清液中促纤维化因子转化生长因子β1 (TGFβ1)和ECM成分Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的水平。以CRP0、0.1、1、10μg/ml浓度刺激HK-2细胞24h;用10μg/ml CRP培养Oh、12h、24h、48h, Real-time PCR TGFβ1检测mRNA表达。以CRP0、0.1、1、10μg/ml浓度刺激HK-2细胞24h；用10μg/mlCRP培养0h、6h、12h、24h,Real-time PCR检测趋化因子CX3CL1 (Fractalkine) mRNA表达。结果：1.CRP对HK-2细胞分泌TGFβ1、ColⅠ、ColⅣ的影响：CRP以剂量依赖方式上调肾小管上皮细胞TGFβ1、ColⅠ、ColⅣ分泌(P<0.001)。TGFβ1, ColⅠ、ColⅣ分泌随刺激时间延长而升高(P<0.001),24小时达到高峰,呈时间依赖性。2.CRP对HK-2细胞TGFβ1 mRNA表达的影响：TGFβ1 mRNA表达呈剂量依赖性增高(P<0.01), CRP10μg/ml作用24h,TGFβ1mRNA表达较未刺激组升高约3倍(2.70±0.79,P=0.001)。TGFβ1 mRNA表达呈时间依赖性反应增高(P<0.01), CRP10μg/ml刺激24h增高约3倍(2.91±0.68,P=0.001)。3.CRP对HK-2细胞表达趋化因子CX3CL1mRNA的影响：CX3CL1 mRNA表达呈剂量依赖性增高(P=0.01), CRP 10μg/ml CX3CL1 mRNA表达是未刺激组的4.41±0.70倍(P=0.003)。CX3CL1 mRNA表达呈时间依赖性反应(P<0.01),CRP 10μg/ml刺激24h是未刺激组4.36±0.78倍(P<0.001)。结论：CRP刺激上调肾小管上皮细胞致纤维化因子TGFβ1和趋化因子CX3CL1表达并导致细胞外基质ColⅠ、ColⅣ分泌增多,提示CRP对肾小管上皮细胞的活化具有促炎症和纤维化作用。第四章C-反应蛋白诱导肾小管上皮细胞凋亡目的：探讨CRP对肾小管上皮细胞凋亡的影响方法：以0、0.1、1、10、20μg/mlCRP和CRP10μg/ml+抗CRP抗体10μg/ml刺激HK-2细胞48小时；10μg/mlCRP孵育HK-2细胞0h、12h、24h、48h,采用Annexin V-FITC和PI染色,流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。Hoechst33258染色检测肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测Caspase-3活性,Real-time PCR检测凋亡基因BAX、Bcl-2mRNA的表达。Real-time PCR检测促进细胞生长停滞与凋亡的基因GADD153 mRNA的表达。结果：1.流式细胞术检测CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡：CRP以剂量依赖方式诱导HK-2细胞凋亡(P<0.001),细胞凋亡在10μg/ml达高峰,20μg/ml以晚期凋亡和坏死为主。加入CRP中和抗体后,CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡率显著性下降(P<0.001)。CRP以时间依赖方式诱导HK-2细胞凋亡(P<0.001),细胞凋亡在24h开始增高,48h进一步增高。2. Hoechst33258染色检测CRP诱导肾小管上皮细胞凋亡：随着CRP刺激剂量增加,肾小管上皮细胞表现出凋亡的特点,Hoechst33258染色见核染色质浓缩,部分呈核染色质边集和核分裂。3.CRP诱导肾小管上皮细胞Caspase-3酶活性增高：caspase-3活性呈时间依赖性增高(P<0.01),12h达高峰。4.CRP影响肾小管上皮细胞凋亡基因BAX、Bcl-2、GADD153mRNA的表达：BAX mRNA的表达随时间延长而上调(P<0.05),24h达高峰。Bcl-2 mRNA的表达随时间延长而下调(P<0.001),48h下降最低。GADD153 mRNA的表达随剂量增加而上调(P<0.01), CRP10μg/ml达高峰。结论：CRP可诱导肾小管上皮细胞凋亡,提示其具有引起肾小管萎缩的潜在能力。诱导凋亡的机制与Caspase-3凋亡酶活化,促凋亡基因BAX、GADD153上调,抑制凋亡基因Bcl-2下调有关。第五章FcγRⅡa受体在C-反应蛋白诱导的生物学效应中的作用目的：通过FcγRⅡa抗体封闭FcγRⅡa受体,观察CRP诱导的生物学效应的变化,探讨肾小管上皮细胞FcγRⅡa受体在CRP诱导的病理生物学效应中的作用。方法：以CRP0μg/ml、CRP10μg/ml、CRP10μg/ml+IgG10μg/ml、CRP10μg/ml+抗FcγRⅡa(CD32a)抗体10μg/ml刺激HK-2细胞24 h或48h,分别采用ELISA检测细胞培养上清液TGFβ1浓度和细胞外基质ColⅠ、ColⅣ浓度；Real-time PCR检测TGFβ1和趋化因子CXC3CL1 mRNA表达AnnexinⅤ-FITC和PI染色,流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。结果：抗FcγRⅡa抗体封闭FcγRⅡa受体后,CRP作用显著性减弱,TGFβ1、ColⅠ、ColⅣ的分泌分别下降了62.3%、45.9%和58.5%。抗FcγRⅡa抗体封闭FcγRⅡa受体后,TGFβ1和趋化因子CXC3CL1mRNA表达分别显著下调了45.5%和61.5%。抗FcγRⅡa抗体封闭FcγRⅡa受体能完全阻断CRP诱导的细胞凋亡抗FcγRⅡa抗体组细胞凋亡率与未刺激组相近(3.30%±1.78%与3.16%±0.99%,P>0.05),与CRP10μg/ml组比较差异有显著性(3.30%±1.78%与13.48%±1.46%,P<0.001)。用非特异性同源IgG封闭FcγRⅡa受体均不起作用。采用FcγRⅡa抗体阻断FcγRⅡa受体,CRP对肾小管上皮细胞生物学效应被削弱。结论：CRP通过肾小管上皮细胞FcγRⅡa受体介导促纤维化因子TGFβ1和趋化因子CXC3CL1表达上调,促进HK-2细胞ColⅠ和ColⅣ的过表达,进而诱导HK-2细胞凋亡,说明CRP可以通过对FcγRⅡa的结构识别和功能活化介导生物学效应。