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背景脑卒中是造成我国中老年人死亡常见的临床疾病之一,其中缺血性脑卒中占脑卒中发病的70%-80%。脑缺血及缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的病理生理机制极其复杂,主要包括损伤后的氧化应激反应、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞凋亡、线粒体功能障碍、炎症反应等多个环节。其中炎症反应在脑I/R损伤进展机制中扮演着重要的角色,损伤后触发的炎症级联反应会进一步诱导神经元死亡,是造成脑组织继发性损伤的主要因素之一。星型胶质细胞作为脑内分布最为广泛且数量最多的一种细胞,不仅是参与脑缺血再灌注损伤早期炎症反应的主要细胞,并且其可通过产生和分泌抗炎小分子从而减轻炎症损伤。因此,了解星形胶质细胞在炎症反应中的作用及机制,对寻找减轻脑I/R炎性损伤的治疗策略具有重要意义。DJ-1(也称为PARK7),作为一种多功能蛋白,在神经退行性疾病帕金森病以及脑卒中的反应性星形胶质细胞中大量表达。我们前期的研究也表明,脑I/R损伤后,DJ-1在反应性星形胶质细胞中表达上调,且上调的DJ-1具有神经保护功能。最近,有研究发现星形胶质细胞的DJ-1在抗炎方面发挥重要的作用。但是,目前DJ-1在脑I/R损伤中发挥抗炎作用的具体机制还尚不清楚。目的本研究旨在探讨DJ-1对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应的调控作用及其相关机制。方法(1)本实验以雄性成年SD大鼠和新生SD大鼠(1d)提取的星型胶质细胞为研究对象,分别应用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)/再灌注(Reperfusion)模型和应用无氧无糖无血清培养法建立星形胶质细胞氧糖剥夺/再灌注(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)模型,模拟体内外大鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤。(2)建立大鼠MCAO/R模型,大鼠大脑中动脉栓塞时间为1h,再灌注时间点选取4h、8h、12h、24h、48h,在上述五个时间点应用Western blot实验检测DJ-1蛋白水平。(3)建立星形胶质细胞OGD/R模型,氧糖剥夺时间点选取1h、2h、3h、4h、5h、6h,再灌注时间为24h,在上述六个时间点应用Western blot实验检测DJ-1蛋白水平。(4)建立大鼠MCAO/R模型,并于建模前24h行左侧脑室注射DJ-1 siRNA,观察干扰DJ-1对MCAO/R后大鼠神经学功能、脑梗死体积、脑组织形态学的影响。(5)建立星形胶质细胞OGD/R模型,并于建模前72h培养基中加入DJ-1干扰慢病毒载体,采用CCK-8法检测干扰DJ-1对OGD/R后星型胶质细胞存活率的影响。(6)采用Western Blot实验检测干扰DJ-1对SHP-1、TRAF6、NLRX1以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响。并用ELISA实验检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。(7)采用免疫荧光染色实验观察干扰DJ-1对NLRX1的亚细胞定位的影响。并用免疫共沉淀(CO-IP)实验检测NLRX1与TRAF6之间相互作用以及SHP-1与TRAF6之间相互作用的情况。(8)建立大鼠MCAO/R模型,于建模前1月左侧大脑皮质注射DJ-1过表达腺相关病毒载体(Adeno-Associated Virus,AAV),同时于建模后腹腔注射SHP-1抑制剂TPI-1。体外建立星形胶质细胞OGD/R模型,并于建模前72h培养基中加入DJ-1过表达慢病毒载体,同时于OGD后培养基中加入SHP-1抑制剂TPI-1。(9)采用Western Blot实验检测SHP-1、TRAF6、NLRX1以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达情况。并用ELISA实验检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。(10)采用Co-IP实验检测NLRX1与TRAF6之间相互作用以及SHP-1与TRAF6之间相互作用的情况。结果(1)体内,DJ-1蛋白于缺血后24h达到高峰;体外,DJ-1蛋白于氧糖剥夺5h/再灌注24h达到高峰。(2)干扰DJ-1明显加重MCAO/R后大鼠神经功能缺损,增大脑梗死体积,加重神经细胞损伤。同时,干扰DJ-1明显降低OGD/R后星型胶质细胞的存活率。(3)脑I/R损伤后,DJ-1、SHP-1、TRAF6、NLRX1以及炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达均显著增加。干扰DJ-1后,DJ-1和SHP-1的表达下降,而TRAF6和炎性细胞因子的表达进一步增加,值得注意的是,NLRX1的表达水平未受明显影响。随后的CO-IP结果显示,脑I/R损伤后,NLRX1与TRAF6的结合减弱,而SHP-1与TRAF6的结合增强。而干扰DJ-1后,NLRX1与TRAF6结合明显增强,SHP-1与TRAF6的结合显著减弱。(4)过表达DJ-1后,DJ-1和SHP-1表达明显增加,而TRAF6和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达显著降低。使用SHP-1抑制剂以后,SHP-1表达降低,TRAF6和炎性细胞因子的表达增加,而DJ-1的表达无明显变化。值得注意的是,DJ-1或SHP-1的变化对NLRX1的水平均没有影响。在随后的实验中,过表达DJ-1促进SHP-1与TRAF6结合,且诱导NLRX1与TRAF6解离。而使用SHP-1抑制剂后,SHP-1与TRAF6的结合被抑制,NLRX1与TRAF6的解离被逆转。结论DJ-1通过诱导NLRX1-TRAF6解离减轻大鼠脑I/R炎症损伤。而DJ-1诱导NLRX1与TRAF6解离的机制可能是通过上调SHP-1促进SHP-1与TRAF6结合来实现。