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E-钙粘蛋白(E-cadherin)是主要分布于上皮细胞表面的I型跨膜糖蛋白，它不仅参与形成细胞间粘附连接(adherens junctions，AJs)、维持细胞极性和组织完整性，更重要的是它将细胞外信息传导入细胞内，介导细胞间的信息传递。E-钙粘蛋白能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移，大量文献证实，许多恶性肿瘤的发生都伴有E-钙粘蛋白表达降低或功能缺失，因此E-钙粘蛋白被认为是一种重要的肿瘤抑制分子。
E-钙粘蛋白主要由胞外、跨膜及胞内肽段三部分组成。由人E-钙粘蛋白氨基酸序列推测(Gene Bank Accession No．L08599)，E-钙粘蛋白胞外肽段存在四个潜在的N-糖基化位点(N-X-S/T)，分别位于Asn 554、Asn 566、Asn 618及Asn 633(N554、N566、N618及N633)。虽然E-钙粘蛋白在介导钙离子依赖的细胞间粘附、抑制肿瘤发展方面具有重要的生物学功能，但是至今我们对其N-糖基化结构及功能的了解并不深入。
为了深入阐明E-钙粘蛋白N-糖基化的结构及功能，实验室前期，分别或联合地将这四个潜在N-糖基化位点的一致性序列(NXS/T)中的天冬酰胺突变为谷氨酰胺，构建了一系列缺失E-钙粘蛋白不同位点N-糖基化的突变E-钙粘蛋白真核基因表达质粒，并将这些质粒转染入本身不表达E-钙粘蛋白的高侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-435中，筛选后获得八株稳定表达细胞株。前期实验还发现，N633位点的N-糖基化似乎对于E-钙粘蛋白的稳定表达至关重要，去除这一位点的N-糖基化，E-钙粘蛋白在蛋白水平不能够表达。
如前所述，人E-钙粘蛋白胞外肽段存在四个潜在的N-糖基化位点，由于糖蛋白并非每个潜在N-糖基化位点都一定发生N-糖基化修饰，
本文的第一部分首先鉴定E-钙粘蛋白四个潜在N-糖基化位点是否存在N-糖基化，并应用质谱技术及糖苷酶酶切的方法初步了解N-糖链的结构。研究发现，E-钙粘蛋白四个潜在的N-糖基化位点都存在N-糖基化修饰，而且这四个位点的N-糖链可能都是复杂型N-糖链。
有文献报道，N-糖基化的异常修饰可能影响钙粘蛋白介导的细胞粘附。高尔基体内的糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(GnT-V)过表达，催化N-钙粘蛋白使其β1-6分支的N-糖链结构增加，N-钙粘蛋白介导的细胞粘附能力明显下降；而高尔基体内另外一种与GnT-V有竞争性的糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ(GnT-Ⅲ)过表达，催化E-钙粘蛋白使其平分型的N-乙酰氨基葡萄糖链结构增加时，E-钙粘蛋白介导的细胞粘附能力增加。这些研究结果提示，N-糖基化结构的改变可能影响钙粘蛋白介导的细胞粘附，但N-糖基化如何影响E-钙粘蛋白介导的细胞粘附及其分子机制目前并没有报道。
本文的第二部分系统研究这一问题。
应用细胞聚集实验我们发现，E-钙粘蛋白N554、N566两个位点的N-糖基化显著影响E-钙粘蛋白的细胞粘附功能，去除这两个位点N-糖基化细胞粘附能力显著下降伴而迁移能力增加；而N618位点的N-糖基化似乎对于E-钙粘蛋白的粘附功能及细胞的迁移能力没有显著影响。在本文第三部分研究中，我们进一步探讨了N-糖基化影响E-钙粘蛋白细胞粘附功能的分子机制。我们首先应用放线菌酮初步分析N-糖基化对蛋白稳定性的影响。
研究发现，与N633位点显著影响蛋白稳定性不同，N554、N566和N618位点的N-糖基化基本不影响蛋白稳定表达。免疫荧光及Triton X-100抽提实验证实，这三个位点的N-糖基化也并不影响E-钙粘蛋白在细胞表面及细胞粘附连接处(adherens junctions，AJs)的表达，这样的结果说明，N-糖基化并非通过影响E-钙粘蛋白稳定性或E-钙粘蛋白在细胞粘附连接处的表达进而影响细胞粘附。那么，N-糖基化如何影响E-钙粘蛋白的粘附功能呢?我们随后的研究发现，去除E-钙粘蛋白N554，N566和N618位点的N-糖基化会引起β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。而β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高往往会导致E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物解体。接下来，通过对细胞粘附连接复合物进行分析，我们发现，去除E-钙粘蛋白N554、N566和N618位点N-糖基化后细胞粘附连接处β-连环蛋白及a-连环蛋白含量明显下降。因此我们得出结论，E-钙粘蛋白N554、N566和N618位点的N-糖基化通过影响β-连环蛋白的酪氨酸磷酸化水平，调节细胞粘附连接复合物中β-，a-连环蛋白的含量，最终影响细胞与细胞之间的粘附能力。
作为重要肿瘤抑制分子，E-钙粘蛋白能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移，影响肿瘤的恶性行为。那么N-糖基化是否参与E-钙粘蛋白对肿瘤细胞生物学行为的影响?在本文第四部分的研究中，我们探讨了E-钙粘蛋白N-糖基化对细胞周期进程的影响。研究发现，在MDA-MB-435细胞中，野生型E-钙粘蛋白能够抑制周期蛋白cyclin Dl的表达，抑制细胞由Gl向S期转化，导致细胞出现Gl期阻滞；然而，随后的实验发现N554、N566及N618位点N-糖基化对于E-钙粘蛋白对细胞Gl/S转化的抑制效应是十分关键的，一旦去除这三个位点N-糖基化，突变E-钙粘蛋白似乎不能够抑制MDA—MB-435细胞由G1期向S期的转化。我们进一步研究发现E-钙粘蛋白这三个位点的N-糖基化通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路影响了MDA-MB-435细胞Gl/S期的转化。值得注意的是，N554、566两个位点的N-糖基化，尤其前者，显著影响E-钙粘蛋白对Gl/S转化的抑制。本论文研究发现，不同位点N-糖基化对E-钙粘蛋白稳定性及生物学功能的影响不同。N633位点N-糖基化显著影响E-钙粘蛋白的稳定性，而其它三个位点N-糖基化对蛋白稳定性影响不大。而N554、566位点N-糖基化通过影响β-连环蛋白酪氨酸磷酸化水平，影响E-钙粘蛋白的细胞粘附功能。另外，N554、566位点N-糖基化通过ERK信号通路影响细胞周期的进程，这可能由细胞粘附能力下降引起。而N618位点N-糖基化无论对于E-钙粘蛋白的粘附功能还是对于MDA-MB-435细胞周期的进程均无显著影响。